Análisis de las modificaciones post-traduccionales de la proteína TAU presente en líquido cefalorraquídeo de pacientes con paraparesia espástica tropical

Abstract

La enfermedad neurológica conocida como Paraparesia Espástica Tropical, mielopatía asociada al HTLV-I (TSP/HAM) se caracteriza por la degeneración axonal de los haces córtico-espinales. Aunque no se conoce mucho como el HTLV-I afecta selectivamente a los axones más largos del sistema nervioso central (SNC), es la proteína viral Tax secretada desde los linfocitos T-CD4+ el principal candidato por su actividad estimuladora de factores transcripcionales a través de varias vías de señalización. Esta proteína, se encuentra presente en forma crónica en el líquido cefalorraquídeo (LCR), pudiendo alterar el transporte axonal actuando extracelularmente, siendo afectados principalmente los axones más largos por su mayor vulnerabilidad. Estudios in vitro de la proteína Tax muestran que se une a varias proteínas celulares que regulan vías relacionadas con la transcripción y el citoesqueleto, incluyendo fosfatasas y quinasas, por lo que se sugiere que en esta patogenia podría haber un desbalance en el nivel de fosforilación/desfosforilación de las proteínas del citoesqueleto. Se han propuesto como biomarcadores de varias enfermedades neurodegenerativas los niveles de Tau total y/o fosfo-Tau en el LCR. Por lo tanto, los objetivos de esta investigación fueron comparar la fosforilación de Tau presente en el LCR de pacientes con TSP/HAM y sujetos controles, a fin de aclarar si estas proteínas están involucradas en la patogenia de esta enfermedad, y aislar la proteína Tau desde el LCR para posteriores estudios de proteómica de sus fosfoformas. Los niveles de Tau en el LCR y la evaluación del patrón molecular de fosforilación de residuos específicos como Tre181, Ser199, Tre205, Tre231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 y Ser422 fue realizada por “immunowestern blot” utilizando anticuerpos policlonales monoespecíficos. Con todos los anticuerpos ensayados se observó la presencia de una banda principal de 52 kDa. Los niveles de Tau en el LCR de los TSP/HAM no fueron significativamente distintos de los de controles, y aunque no fue significativamente diferente (p = 0,06), se podría sugerir sólo una anormal hiperfosforilación de Tre181. Si se confirmara este mayor nivel fosforilación en Tre181 trabajando con un número mayor de pacientes o utilizando otros métodos más confiables, sugeriría un aumento en la actividad o una sobre-expresión de dos quinasas dirigidas a Ser/Tre-Pro, GSK3-α y β, Cdk5. Una caracterización completa de la fosforilación de los distintos residuos de Tau en el LCR de los controles y pacientes con TSP/HAM requirió la aplicación adicional de la técnica analítica de Espectrometría de Masas (MS). Por lo tanto, se trató de aislar Tau desde LCR utilizando una columna de afinidad por fosfopéptidos de Ga(III), y dos métodos de inmunoprecipitación, uno usando proteínas A/G acopladas a agarosa y una segunda con unión covalente de los anticuerpos (“Sepharose” activada con CNBr). Ni la columna de Ga(III) ni el primer método de inmunoprecipitación fueron adecuados para posterior análisis por MS. Después de demostrar por SDS/PAGE que el método que usaba los anticuerpos unidos covalentemente mostraba una banda principal de 52 kDa, se eluyó la proteína del gel, tripsinizó y analizó por MS MALDI-TOF. Se observó la posible presencia de proteínas asociadas al citoesqueleto que podrían haber coinmunoprecipitados con Tau. Estos resultados no fueron confirmatorios por el bajo “score” observado. En conclusión, dos de los resultados muestran diferencias entre TSP/HAM y varias enfermedades neurodegenerativas: el no aumento en los niveles de Tau total, y la posible hiperfosforilación de sólo Tre181. Fue importante lograr aislar Tau desde el LCR para futuros estudios de MS

The neurological disorder known as tropical spastic paraparesis / HTLV-I-associated myelopathy (TSP/HAM) is characterized by axonal degeneration of the cortico-spinal tracts. Although the selectivity of HTLV-I towards the longest axons of the central nervous system (CNS) is not fully understood, the main candidate is the secreted viral protein Tax from lymphocytes T-CD4+ that shows a stimulatory activity of transcriptional factors acting through several signaling pathways is the main candidate. This protein, chronically present in CSF, could extracellularly alter axonal transport. The longest axons are mainly affected because they are more vulnerable. In vitro studies on Tax protein have shown the binding of this protein to many cellular proteins that regulate transcription and cytoskeleton related pathways including phosphatases and kinases, therefore an imbalance in the level of cytoskeleton phosphorylated/unphosphorylated proteins could be involved in this pathogeny. Levels of total Tau and/or phospho-Tau in the CSF have been proposed as biomarkers of various neurodegenerative diseases. Hence, the aims of this investigation were to compare Tau phosphorylation present in CSF of TSP/HAM patients and control subjects, to elucidate if these proteins are involved in the pathogeny of this disease, and to isolate Tau protein from CSF for further proteomic studies of its phosphoforms. Levels of Tau in CSF and evaluation of the molecular pattern of phosphorylation of selected residues such as Thr181, Ser199, Thr205, Thr231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 and Ser422 were performed by immunowestern blot, using monospecific polyclonal antibodies. With all the antibodies tested we observed a main band with 52 kDa. The CSF levels of Tau in TSP/HAM were not significantly different from those of controls. Only an abnormal hyperphosphorylation on Thr181, although it was not significantly different (p = 0.06), could be suggested in TSP/HAM patients. If a high phosphorylation level in Thr181 is confirmed by working with a larger number of patients or other more reliable methods, it would suggest an increase in activity or over-expression of two Ser/Thr-pro-directed kinases GSK3-α and β, and Cdk5. A complete characterization of Tau phosphorylation sites in CSF from control and TSP/HAM patients required the use of the additional analytical technique of Mass Spectrometry (MS). Therefore, we tried to isolate Tau from CSF samples using the phosphopeptide affinity column with Ga(III), and two immunoprecipitation methods, one using protein A/G-coupled agarose beads and a second one with covalently bound antibodies (Sepharose activated with CNBr). Neither the Ga(III) column nor the first immunoprecipitation method were adequated for MS analysis. After demonstrating by SDS/PAGE that the method that used covalently bound antibodies showed a main band of 52 kDa, the sample was eluted, trypsinized and analyzed in a Mass Spectrometer MALDITOF. This preliminary study suggested the presence of Tau and of some other cytoskeleton associated proteins that could have been coimmunoprecipited with Tau. The low “score” obtained did not allow reach confirmatory results. In conclusions, two of the results showed differences with various neurodegenerative diseases: lack of changes in Tau levels in CSF, and possible hyperphosphorylation of only threonine 181. It was important to have been able to isolate a Tau form from CSF for further studies of MS