Evaluación de la distribución mitocondrial en ovocitos de perra: inmaduros, madurados in vitro y madurados in vivo

Abstract

En caninos, el desarrollo de las biotecnologías reproductivas ha sido inferior en comparación al realizado en otras especies, básicamente debido a la baja eficiencia en la maduración in vitro de los ovocitos. La adecuada maduración comprende tanto al núcleo como al citoplasma, a nivel citoplasmático involucra la redistribución y desarrollo de organelos, entre estos, la organización y la actividad metabólica de las mitocondrias. Sin embargo, no hay mayores antecedentes respecto al desarrollo citoplasmático in vitro en los caninos, por lo que en la presente memoria se estudió la actividad y distribución mitocondrial en ovocitos de perras en estado inmaduro, madurados in vitro por 72 y 96h y madurados in vivo. Se analizó un total de 766 ovocitos obtenidos de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía. Del total de estos ovocitos estudiados, 215 fueron utilizados como inmaduros, 254 fueron madurados durante 72 horas y los otros 297 durante 96 horas. Adicionalmente se analizó una cantidad total de 15 ovocitos madurados in vivo, obtenidos por lavados del oviducto a perras en estro, ovariohisterectomizadas 72 h después de la ovulación, la que se determinó mediante análisis de progesterona sérica. Tanto los ovocitos inmaduros, madurados in vitro y madurados in vivo fueron procesados de forma separada para evaluar la distribución y actividad mitocondrial, usando la sonda de fluorescencia MitoTracker Red CMXRos®. Las observaciones se realizaron en un microscopio invertido con epifluorescencia. La actividad mitocondrial se evaluó de acuerdo a la fluorescencia emitida en alta, media y baja para cada uno de los estados de maduración de los ovocitos y se analizó mediante chi-cuadrado. Se estableció dependencia entre las frecuencias de ovocitos con distintas intensidades de fluorescencia (alta, media, baja) al comparar las muestras provenientes de ovocitos inmaduros, madurados in vitro por 72 y 96 h, y madurados in vivo (chi cuadrado = 30,59; p< 0,01), indicando que la actividad mitocondrial se encuentra directamente asociada al estado de maduración del ovocito de perra. En la actividad mitocondrial todos los ovocitos madurados in vivo presentaron fluorescencia de tipo media, la que predominó en ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro; sin embargo, se observó un aumento en el porcentaje de ovocitos con 3 esta emisión de fluorescencia durante la maduración in vitro que indicaría una actividad mitocondrial progresiva durante el cultivo, asociada al tiempo de maduración. La distribución mitocondrial se evaluó mediante análisis descriptivo, determinándose cuatro patrones: Homogéneo liso completo (A), Homogéneo granuloso completo (B), Heterogéneo granuloso periférico y central (C), y Heterogéneo granuloso central (D). En ovocitos inmaduros se encontraron dos patrones de distribución mitocondrial A (72,1%) y B (27,9%); en aquellos madurados in vitro por 72 h se presentaron los cuatro patrones, predominando el B (63,8%), seguido por C (20,5%), el A (9,8%) y finalmente el D (5,9%). en los ovocitos madurados por 96 h se observaron los patrones, B (63,6%), seguido por C (35,7%) y finalmente D (0,7%). En el caso de los ovocitos madurados in vivo se describió sólo un patrón de distribución mitocondrial que correspondió a B. Con estos antecedentes se indica que en ovocitos inmaduros de perra predomina una distribución uniforme de las mitocondrias en su citoplasma. Además la presentación de tres patrones diferentes en los ovocitos madurados in vitro a aquel descrito en ovocitos madurados in vivo podría indicar que durante la maduración in vitro se producen movimientos de las mitocondrias en el citoplasma ovular. También, las distribuciones de las mitocondrias, variaron a través de la maduración in vitro, asemejándose a aquellos madurados in vivo, sin embargo, hubo diferencias entre ambos tipos de maduración lo que podría estar asociado a las condiciones de cultivo.