Análisis del factor de crecimiento diferencial 9 (GDF-9) y la proteína morfogenética ósea (BMP-15) durante el desarrollo de folículos antrales en ovarios caninos mediante citometría de flujo

Abstract

El ciclo estral de la hembra canina presenta algunas características únicas al ser comparadas con otras especies de mamíferos domésticos. Sin embargo, poco se conoce de las características del desarrollo folicular en relación a otras especies. El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF-9) y la Proteína Morfogenética Ósea 15 (BMP-15), son miembros de la superfamilia de Factores de Crecimiento Transformantes Beta (TGF-β), y han demostrado un rol fundamental en el desarrollo folicular en muchas especies. El objetivo de este estudio fue analizar la presencia de ambas proteínas en células foliculares proveniente de folículos antrales del ovario canino mediante citometría de flujo. Se obtuvieron células de la granulosa y del cúmulo a través de aspiración y raspado de folículos antrales de distintos niveles de desarrollo y en distintas etapas del ciclo estral. Las células se fijaron e incubaron con anticuerpo anti GDF-9 humano y anti BMP-15 de ratón (1:100) y anticuerpos secundarios conjugados con FITC y PerCP (1:500), respectivamente. Al análisis por citometría se hizo un Gate discriminatorio por tamaño y complejidad en el Dot plot inicial y adicionalmente se discriminó con marcadores de CD45 para leucocitos y yoduro de propidio (IP) para eritrocitos y debris en los histogramas correspondientes. Los resultados se analizaron con ANOVA y regresión lineal. La expresión de GDF-9 disminuyó (P<0.05) a medida que avanzó el desarrollo folicular en Anestro y Proestro/Estro, pero aumentó (P<0.05) en Diestro. BMP-15 aumentó (P<0.05) su presencia en folículos antrales más desarrollados en la etapa de Anestro, disminuyendo (P<0.05) en Proestro/Estro al alcanzar un mayor nivel de desarrollo. Estas proteínas por tanto, se expresaron en las células foliculares de caninos en distintas etapas del ciclo estral y de manera diferente durante el desarrollo folicular, donde ambas podrían estar relacionadas con las características particulares.

The estrous cycle of the bitch presents unique features when compared to other domestic mammals, however, little is known about the characteristics of the follicular development compared with other species. The Growth Differential Factor 9 (GDF-9) and Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP-15) are members of the Transforming Growth Factor (TGF-β) superfamily and have demonstrated an important role during the follicular development of many species. The aim of this study was to analyze the presence of both proteins in the follicular cells from canine ovarian antral follicles by flow cytometry. Granulosa and cumulus cells were obtained by aspiration and scraping of antral follicles from different sizes and stages of the estrous cycle. Cells were fixed and incubated with first antibodies against human GDF-9 and mouse BMP-15 (1:100) and second antibodies conjugated with FITC and PerCP (1:500), respectively. A size and complexity discriminatory gate was used for the cytometryc analysis in the initial dot plot and, additionally, a CD45 marker for leukocyte and Iodum Propide for erythrocyte and debris discrimination in the corresponding histograms. The results were analyzed with ANOVA and lineal regression. GDF-9 expression decreased (P<0,05) during follicular development in Anestrous and Proestrous/Estrous, but increased during Diestrous (P<0,05). BMP-15 expression increased (P<0,05) during follicular development in Anestrous, but decreased in roestrous/Estrous (P<0,05) compared to small and medium sizes. Therefore, these proteins are expressed in canine antral follicle cells during different stages of the estrous cycle and at different levels of develop of the antral follicle, where both may be related to the special features of the bitch.