Caracterización biofísica a nivel de molécula individual del plegamiento del regulador transcripcional RfaH

Abstract

La proteína RfaH de E. coli es un regulador transcripcional perteneciente a la ampliamente conservada familia NusG, que incrementa la expresión de genes distales en operones estrechamente relacionados con virulencia. Esta expresión controlada toma lugar de manera posterior al reclutamiento específico de RfaH a una hebra de ADN expuesta en la superficie del complejo de elongación de transcripción, pausado en la secuencia nucleotídica ops. RfaH posee un dominio C-terminal plegado en forma de α-hélice (αCTD) compactada contra la superficie de unión a polimerasa de ARN (ARNP) del dominio N-terminal e inhibiéndolo, mientras que el de su parálogo NusG corresponde a un plegamiento barril-β (βCTD) sin interacción a la ARNP y con alta movilidad. Sin embargo, cuando ambos dominios de RfaH se disocian (evento necesario para unirse a la ARNP), el dominio C-terminal sufre un cambio de plegamiento desde α-hélice a un barril-β idéntico estructuralmente al de NusG, permitiendo la activación del NTD, y además reclutando la proteína ribosómica S10 para acoplar la transcripción con la traducción. RfaH es la primera proteína metamórfica cuyo cambio estructural está asociado a un cambio funcional. Debido a la escasa estabilidad de RfaH en solución la mayoría de los estudios termodinámicos han sido computacionales, sugiriendo la presencia de un intermediario que conecta ambos estados; sin embargo, a la fecha no se ha realizado un análisis profundo que conecte las dinámicas observadas computacionalmente con datos experimentales contrastables. En este trabajo de tesis se evaluó si el plegamiento del dominio C-terminal de RfaH ocurre previo al desplegamiento del NTD, con especial énfasis en las características termodinámicas de aquél proceso. Esto se realizó mediante distintos enfoques computacionales incluyendo modelos basados en estructura y dinámica molecular de confinamiento. Computacionalmente, se utilizaron modelos nativo-céntricos para simular el desplegado mecánico de RfaH en ambos estados nativos. A pesar de que estos modelos se han usado consistentemente para estudiar fenómenos de plegamiento, las magnitudes computacionales o “reducidas” no se encuentran calibradas respecto a su contraparte experimental. Por ello, inicialmente se estudió el desplegado mecánico de 35 proteínas depositadas en el PDB para poder estimar la capacidad de estos modelos de reproducir características experimentales. Utilizando ponderación por orden de contacto, se obtuvo una aproximación lineal de las fuerzas estimadas/experimentales (R=0,934) con un error estándar de 56 pN. Al realizar simulaciones de estiramiento de RfaH en estas condiciones, se observó consistentemente que el CTD se despliega independiente del NTD. A una velocidad de 100 nm∙s-1, la disociación y desplegado del αCTD ocurre a 43 ± 6 pN, mientras que el βCTD se despliega a los 35 ± 5 pN dando lugar a la formación de un intermediario β-extendido, que expone su núcleo hidrofóbico y se despliega a los 29 ± 4 pN. Utilizando este enfoque también se modeló el replegamiento del CTD en ambos estados. Mostrando alta histéresis para el caso del αCTD, y distribuciones de trabajo solapantes con las del desplegamiento para ambos pasos de desplegamiento del βCTD, permitiendo estimar un ΔG de 12,0 y 8,7 kcal mol-1 para la reacción βCTD ⇄ I ⇄ desplegado, respectivamente. Por otro lado, se calculó la estabilidad de ambos estados mediante dinámica molecular de confinamiento, entregando un ΔG = 6,5 kcal∙mol-1 para la reacción αRfaH ⇄ βRfaH. Una descomposición a nivel de residuo de esta diferencia de energía muestra alta correlación con la estabilidad relativa calculada a partir de espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio. Esto permitió identificar una estabilidad diferencial de segmentos al interior de RfaH, en la cual los residuos 129-146 están altamente estabilizados en el αCTD asociado al NTD, mientras que las otras dos regiones 115-128 y 147-162 favorecen enormemente un plegamiento βCTD, y apoyan la predicción energética predicha por las dinámicas de confinamiento. Este trabajo corresponde a la primera investigación termodinámica de la transición de RfaH, dando luces además de los directores en secuencia de esta transformación, y caracterizando su estabilidad y vía por la cual se conecta con el estado desplegado

The idea of a singular native state has been overruled by metamorphic proteins such as RfaH. This is a transcription factor composed of two domains: The N-terminal (NTD, 100 residues) and C-terminal (52 residues) domains. In solution this protein is autoinhibited, and it becomes activated by completely refolding its C-terminal domain from its initial α-hairpin to a β-barrel when binding to the transcriptional machinery. Through multiple molecular dynamics approaches, it was possible to computationally characterize and predict the folding pathways of both RfaH states, and estimate the free-energy difference required for converting them. Using structure-based models, the single-molecule mechanical unfolding of α-folded RfaH was simulated, which takes place by two sequential events: the simultaneous dissociation and unfolding of its α-helical C-terminal domain (αCTD), and a secondary unfolding of the NTD. On the other hand, when starting from the β-folded C-terminal domain (βCTD), RfaH unfolding occurs mediated by two different intermediates: first, the β-barrel opens and becomes solvent exposed turning into an extended-β intermediate. In a tertiary transition, this intermediate is unfolded and only the NTD remains structured, which shares the same folding characteristics as when unfolding from the α-state RfaH. Analysis of the unfolding of 35 different proteins using structure-based models allowed for estimation of forces from simulations. Using this approach, reversible unfolding of CTD was performed, yielding high hysteresis between the un- and refolding of the αCTD; and overlapping work distributions for such processes in the βCTD, enabling equilibrium free energy calculation through Crooks fluctuation theorem. Thus, the predicted ΔG° values for the reaction βCTD ⇄ Intermediate ⇄ unfolded are 12.0 and 8.7 kcal mol-1 respectively. By using confinement molecular dynamics, it was possible to estimate the free energy of the RfaH metamorphosis (αRfaH ⇄ βRfaH) calculated to be 6.5 kcal mol-1. The further decomposition of this free energy is highly correlated with thermodynamic analysis of hydrogen-deuterium mass spectrometry experiments performed for both CTD states. Altogether, this research provides insights into the folding mechanism and thermodynamics of the metamorphic RfaH protein, constituting a significant step forward in understanding the molecular determinants behind the duality of metamorphic proteins