Caracterización del mecanismo de plegamiento de una versión monomérica del represor AR, un miembro de la superfamilia RHH con topología anudada, mediante espectroscopia de fuerza de trampa óptica

Abstract

La topología de una proteína, definida como el camino tridimensional que sigue la cadena polipeptídica en el espacio, impone restricciones naturales al conjunto de movimientos que esta puede realizar para alcanzar su estado nativo. Por esta razón esta propiedad define el mecanismo de plegamiento de una proteína. Sin embargo, en los últimos años se han descrito proteínas que obligan a la cadena polipeptídica a buscar su camino de plegamiento a través de intrincados y complejos movimientos, es el caso de las proteínas anudadas. Estas proteínas suponen un desafío para las teorías de plegamiento actuales y han abierto nuevas interrogantes respecto al mecanismo de plegamiento de las proteínas. La primera proteína anudada fue identificada en el año 2000, desde entonces se han descrito muchas otras llegando a representar del 2% del Protein data bank (PDB). Esta baja abundancia relativa de proteínas anudadas contrasta con lo observado en simulaciones de modelos de polímeros que indican que la probabilidad de formar este tipo de estructuras es alta. Esto hace pensar que las proteínas evitan la formación de nudos. No obstante no se conoce la tendencia natural de una proteína a anudarse. Otra interrogante que nace del estudio de proteínas anudadas tiene relación con la función que cumplen estas estructuras en las proteínas que las presentan y cómo estas proteínas logran plegarse. Se ha demostrado que algunos motivos anudados se conservan en distintas familias y superfamilias a pesar de su baja identidad de secuencia. Esta evidencia sugiere que dichos motivos podrían aportar alguna ventaja comparativa a las proteínas que los presentan. En este aspecto, estudios teóricos y evidencias experimentales indican que la topología anudada podría aumentar la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, ninguno de dichos estudios explica cómo la topología anudada confiere estabilidad. En este trabajo tratamos de determinar las consecuencias que tiene sobre el mecanismo de plegamiento de una proteína el obligar a su cadena polipeptídica a anudarse. Para ello se comparó el proceso de plegamiento de una proteína anuda con la de su contraparte no-anudada. Experimentalmente esto sugiere dos desafíos importantes: primero, es necesario que la formación del nudo no altere significativamente la estructura de la proteína. Segundo, es indispensable poder controlar la topología del estado desplegado para asegurar la homogeneidad de los estados termodinámicos estudiados. El primer desafío fue abordado utilizando como modelo de estudio la proteína mARC de la superfamilia de factores de transcripción RHH. Esta es una versión monomérica del represor ARC del fago p22 generada al unir el extremo carboxilo de una subunidad con el extremo amino de la siguiente utilizando un péptido conector de 15 aminoácidos rico en glicina. Modelos por homología de mARC muestran que el péptido conector puede formar un lazo flexible que no genera contactos con el centro hidrofóbico de la proteína. De esta manera, dependiendo de la posición de dicho lazo se pueden generar dos conformaciones de mARC, una conformación anudada y otra no-anudada. El segundo desafío experimental fue abordado caracterizando el mecanismo de plegamiento de mARC utilizando pinzas ópticas. Esta aproximación permite estirar la proteína desde sus extremos y aplicar una fuerza sobre ella, de esta forma se puede controlar la topología del estado desplegado y con ello poder comparar la diferencia de energía libre entre el estado desplegado anudado y no-anudado de mARC. Por otra parte, mediante un rearreglo de los elementos de estructura secundaria de mARC puede generarse una permutante no circular de ella, pARC. Esta proteína presenta la misma arquitectura y estabilidad al equilibrio que mARC pero su topología le impide formar nudos. Así, esta permutante fue utilizada como control del efecto topológico del anudamiento de mARC. Los resultados obtenidos al estirar mARC a velocidad constante permitieron identificar dos tipos de moléculas con largos de contorno (L0 largo de una molécula completamente estirada) diferentes. Un grupo de moléculas presentó un L0 de 37 ± 7 nm, que coincide con lo esperado para la conformación anudada de mARC. El otro grupo mostró un L0 de 43 ± 7 nm, esperado para la conformación no-anudada de esta proteína. Al contrario, pARC sólo mostró un tipo de moléculas con un L0 de 22 ± 7 nm. De estos resultados se concluye que mARC está presente en dos conformaciones, una anudada y otra no anudada. De los experimentos de estiramiento a velocidad constante se obtuvo el trabajo irreversible, realizado fuera del equilibrio, asociado a las transiciones de desplegamiento y replegamiento de mARC y pARC. Utilizando el teorema de Crooks fue posible calcular, a partir de estos datos, el ΔG en condición de equilibrio para el desplegamiento de las conformaciones anudada (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol) y no-anudada (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) de mARC así como también de pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). Estos resultados indican que mARC anudado es más estable que mARC no-anudado por 8,9 ± 0,9 kcal/mol, este valor corresponde al costo energético de anudar una cadena polipeptídica de 120 residuos en su estado desplegado. Esta es la primera vez que es posible determinar experimentalmente este valor. Además, esta diferencia de energía explica, cómo es que la topología anudada confiere estabilidad en esta proteína. Para caracterizar cinéticamente las proteínas se realizaron experimentos a fuerza constante. Sólo fue posible estudiar dos moléculas de mARC las cuales, a pesar de las diferencias que muestran en sus parámetros cinéticos calculados, corresponden a la conformación no-anudada de la proteína. No fue posible realizar estudios cinéticos con pARC

The topology of a protein, defined as the tridimensional path of the polypeptide chain in space, restricts the moves that the chain can perform for searching its native state. For this reason this property defines the folding mechanism of a protein. However, in recent years has been discovered some proteins that seek their native states through complex and intricate movements. Such is the case of knotted proteins which topology challenge current theories of protein folding and have opened new questions about protein folding mechanisms. The first knotted structure was identified in 2000, since then many others have been discovered reaching the 2% of the structures in the Protein data bank (PDB). The low relative abundance of the knotted structures contrast with simulation of polymer models showing that knotted structures are easy to exist in those systems. This suggests that proteins somehow have avoided knotted topologies. Another interesting thing to investigate about knotted proteins is the function that may have the knotted topology on this proteins and how that structures may fold. It has been determined that some knotted motifs are conserved in families and superfamilies despite of the low sequence identity. These results suggest that knotted motifs could provide some comparative advantage with respect to normal proteins. In this regard some theoretical and experimental evidence show that knotted topologies could enhance the stability of proteins. Nevertheless, none of these studies explain how this topologies does it. In this work we seek to elucidate the energetic consequence that brings the knotting of a polypeptide chain to its folding mechanism. For this, we compare the folding process of a knotted protein with their unknotted counterpart. In terms of experimental approach this problem impose two challenges, the first one is that the knot formation should don’t disturb the structure of the protein. The second one is that we must control de topology of the unfolded state in order to ensure the homogeneity of the thermodynamic species under experimentation. The first challenge was archived using the mARC protein from the RHH superfamily of transcription factors. This protein is a monomeric version of the ARC repressor from the p22 phage and it was constructed connecting the C terminus of the first subunit to the N terminus of the next one using a 15 residue glycine-rich polypeptide linker. Structural models mARC shows that the linker forms a flexible loop that doesn’t form contacts with hydrophobic core of the protein. Moreover, homology models indicate that the loop can move around the protein generating two conformations: a knotted and an unknotted one. The second challenge was addressed by characterizing the folding mechanism of mARC using optical tweezers. This approximation allows us to pull the protein from its C and N-terminal ends to control the topology of the unfolded state and thus to compare the energy differences between the knotted unfolded state and the unknotted unfolded state of mARC. In the other hand, by a rearrangement of the secondary structure of mARC it is possible to generate a non-cyclic permutant, pARC. This protein is reported to have the same architecture and folding stability of mARC but, its topology prevents knotting. So, pARC was used as a topological control of the effect of knotting the mARC protein. We found that mARC can be captured in two conformations characterized by different contour length (L0, total extension of a polymer chain). One group of molecules has a L0 of 43 ± 7 nm and corresponds to the expected for the unknotted conformation of mARC. The other group of molecules shows a L0 of 37 ± 7 nm and corresponds to the expected for the knotted conformation. On the contrary pARC only shows one type of molecules characterized by a L0 of 22 ± 7 nm. All together these results support the hypothesis that mARC is present in two conformations, one knotted and other unknotted. Moreover, applying Crook’s theorem to the irreversible work associated to the unfolding and refolding transitions of mARC and pARC allowed to determine the free energy (ΔG) at equilibrium required to the unfold the knotted (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol), unknotted (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) conformations of mARC and pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). These results indicate that knotted mARC is more stable than their unknotted counterpart by 8,9 ± 0,9 kcal/mol mainly due to the energetic cost to tie the unfolded state of the protein. This value corresponds to the energetic cost of knotting a polypeptide chain of 120 residues in its unfolded state and explains the source of the stabilizing effect of the knotted topology in mARC. For the kinetic characterization we performed constant force experiments. It was only possible to study two molecules of mARC. Despite of the differences between the kinetic parameters calculated for them, both corresponds to the unknotted conformation of the protein