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Aproximación a la validación de método bioinformático de termoestabilización, basado en la enzima exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium, mediante reemplazo de aminoácidos por cisteínas en su dominio catalítico y su expresión en Pichia pastoris.

Professor Guidedc.contributor.advisorLienqueo Contreras, María Elena
Authordc.contributor.authorAranda Soto, Natalia Beatriz 
Associate professordc.contributor.otherStange Klein, Claudia
Admission datedc.date.accessioned2019-10-10T15:31:39Z
Available datedc.date.available2019-10-10T15:31:39Z
Publication datedc.date.issued2019
Identifierdc.identifier.urihttp://repositorio.uchile.cl/handle/2250/171111
General notedc.descriptionSeminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular.es_ES
Abstractdc.description.abstractActualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa, ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria, cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de detergentes, papelera, y de biocombustibles. En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4 glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura, el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa. En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P. pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k. La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad asociada a ellas.es_ES
Lenguagedc.language.isoeses_ES
Publisherdc.publisherUniversidad de Chilees_ES
Type of licensedc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile*
Link to Licensedc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/*
Keywordsdc.subjectEnzimas celulasases_ES
Keywordsdc.subjectCelulosaes_ES
Keywordsdc.subjectPhanerochaete chrysosporiumes_ES
Keywordsdc.subjectHongoses_ES
Títulodc.titleAproximación a la validación de método bioinformático de termoestabilización, basado en la enzima exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium, mediante reemplazo de aminoácidos por cisteínas en su dominio catalítico y su expresión en Pichia pastoris.es_ES
Document typedc.typeTesises_ES
Catalogueruchile.catalogadorllses_ES
Departmentuchile.departamentoEscuela de Pregradoes_ES
Facultyuchile.facultadFacultad de Cienciases_ES


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