Aislamiento y análisis del grado de fosforilación de los neurofilamentos de líquido cefalorraquídeo de pacientes con paraparesia espástica tropical

Abstract

La patología neurológica conocida como paraparesia espástica tropical o TSP/HAM (“tropical spastic paraparesis/HTLV-I associated myelopathy”) se produce por la infección con el retrovirus HTLV-I. El material genético del virus se inserta mayoritariamente en el DNA de los linfocitos T-CD4+, pero no en el neuronas, desde donde produce la secreción de proteínas virales como la proteína Tax. Esta enfermedad es crónica y lentamente progresiva donde se observa una degeneración con desmielinización de los axones de las neuronas motoras superiores del haz corticoespinal. La patogenia de esta patología no está aún claramente comprendida. Estudios en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con diversas enfermedades neurodegenerativas correlacionan el daño con la hiperfosforilación de las subunidades de los neurofilamentos (NFs), lo que provoca una alteración del ensamblaje de sus tres subunidades (NF-L, neurofilamento liviano; NF-M, neurofilamento mediano; NF-H, neurofilamento pesado). En este trabajo se plantea que productos virales podrían producir una desregulación de la fosforilación/desfosforilación de los NFs porque estudios in vitro e in vivo han mostrado que la proteína Tax inhibe a la fosfatasa PP2A, y activa a algunas quinasas. El objetivo central de esta investigación fue determinar si en esta patología hay cambios en los niveles de las subunidades de los NFs y su grado de fosforilación medidos en muestras de LCR de pacientes con TSP/HAM y controles. Para llevar a cabo esto se procedió a determinar mediante métodos inmunológicos los niveles de las distintas subunidades de los NFs junto con la existencia de diferencias en el grado de fosforilación de residuos de treonina y serina. Para poder hacer a futuro, análisis proteómico por Espectrometría de Masas de las formas fosforiladas de NF-L, NF-M y NF-H, se emplearon diversas técnicas de afinidad. Estas incluyeron inmunoprecipitación con anticuerpos mono y policlonales específicos para las tres subunidades y uso de columnas de Ga3+, las que presentan afinidad por péptidos fosforilados. Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles/mg de albúmina de la banda de 66 kDa de NF-L en el LCR de pacientes y controles, pero sí un aumento significativo en los de una banda de 59 kDa, la cuál podría ser un producto de degradación del NF-L. No fue posible asociar la banda de 66 kDa con el nivel de fosforilación en treonina y serina por la amplia banda inmunoreactiva frente a anticuerpos contra fosfotreonina y fosfoserina. La banda de 59 kDa no mostró señal con estos anticuerpos contra residuos fosforilados, indicando que su nivel de fosforilación debe ser menor que el de la banda de mayor masa molecular. La detección de NF-M requirió la previa concentración del LCR por precipitación de proteínas con acetona, y condiciones distintas en el “immunowestern blot” que las utilizadas para el NF-L. Se observó la presencia de dos bandas de masas moleculares 170 y 150 kDa reconocidas por los anticuerpos contra NF-M. De estas dos bandas se encontró que el nivel de la de 150 kDa estaba significativamente disminuido en los pacientes, respecto a los controles. Estas dos bandas mostraron un patrón similar de fosforilación en treonina y serina, no encontrándose diferencias entre ambos grupos. No fue posible detectar la presencia de la subunidad de NF-H ni siquiera en el LCR concentrado. Sólo se observaron bandas entre 100 y 200 kDa después de inmunoprecipitarla, dependiendo de la técnica empleada para dicho propósito. El aislamiento de NF-L se realizó mediante dos técnicas de inmunoprecipitación con anticuerpos unidos no covalentemente a proteína A/G agarosa o unidos covalentemente a CNBr-Sefarosa, encontrándose que esta última mostraba menos proteínas contaminantes para su posterior análisis por Espectrometría de Masas. La columna de Ga3+ fue adecuada también, puesto que se observó un patrón de bandas reactivas contra NF-L, similar al del inmunoprecipitado. Aplicando la técnica de inmunopecipitación con proteína A/G agarosa para el NFM, se obtuvo el mismo patrón de bandas inmunoreactivas utilizando anticuerpos contra NF-M, que el observado en LCR concentrado. En resumen, estos resultados mostraron en LCR de pacientes con TSP/HAM un aumento de una banda proteica que podría corresponder a NF-L parcialmente degradado, y una disminución de la banda de menos masa molecular de NF-M. No se pudo determinar por este método inmunológico diferencias en el grado de fosforilación del NF-L entre ambos grupos. En el caso de NF-M sí se pudo asociar las bandas correspondientes a NF-M con la presencia de fosforilaciones en treonina y serina, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre los dos grupos de estudio. Para futuros análisis de proteómica se demostró en esta memoria que la inmunoprecipitación de NF-L desde LCR mediante la técnica que utiliza anticuerpos unidos covalentemente a Sefarosa evita la contaminación de los anticuerpos primarios facilitando los análisis por Espectrometría de Masas. En el caso de NF-M, por su masa molecular se podría utilizar cualquiera de las dos metódicas. Por otra parte, la cromatografía de Ga3+ requiere de mayores estudios para determinar su aplicación en el aislamiento de NFs fosforilados.

Tropical spastic paraparesis or TSP/HAM (“tropical spastic paraparesis/HTLV-I associated myelopathy”) is a neurological disorder produced by the retroviral infection with HTLV-I. The virus genetic material is mainly inserted in DNA of T-CD4+ lymphocytes, but not in neurons, releasing viral proteins from infected T-cells such as Tax protein. This is a chronic and slowly progressive disorder, with degeneration and demyelinization of upper motoneuron axons of corticospinal-tract. The pathogeny of this pathology is not clearly understood so far. Studies on cerebrospinal fluid (CSF) of patients with various neurodegenerative disorders show a correlation of the damage with the hyperphosphorylation of the neurofilament subunits (NFs), producing an alteration in the assembly of its three subunits (NF-L, neurofilament light; NF-M, neurofilament median; NF-H, neurofilament high). In this work we purpose that viral products may produce a dysregulation of the phosphorylation/desphosphorylation of NFs deduced from in vitro and in vivo studies that show the inhibitory effect of Tax protein on PP2A phosphatase, and activation of some kinases. The central objective of this research was to determine the existence in this pathology of changes in the levels of the NF-subunits and in their phosphorylation degree, measured in CSF samples of TSP/HAM patients and controls. To carry out these purposes we measured the levels of the NF subunits by immunological methods and followed the existence of differences in the degree of phosphorylation in threonine and serine. For future proteomic analysis by Mass Spectrometry of the phosphorylated forms of NF-L, NF-M and NF-H we employed several affinity techniques including immunoprecipitation with monoclonal and polyclonal monospecific antibodies and a Ga3+-column with affinity for phosphorylated peptides. Results did not show statistic significant differences in the levels/mg albumin of the 66-kDa band of NF-L in CSF of patients and controls, however significant increased difference in the 59-kDa band was found, that probably corresponds to a degradation product. The association of the 66-kDa band with the phosphorylation level of threonine and serine was not possible. The 59-kDa band did not show signal with these antibodies against phosphorylated residues suggesting that its phosphorylation level should be lower than that at the higher molecular mass band. Detection of NF-M required the previous concentration of the CSF by protein precipitation with acetone, and immunowestern blot conditions different to those used for NF-L. Two bands of 170 kDa and 150 kDa were recognized by antibodies against NF-M. The level of the 150-kDa band was significantly reduced in patients compared with controls. The two bands showed a similar threonine/serine phosphorylation pattern without differences between groups. The NF-H subunit was not detected even using concentrated CSF. Bands between 100 kDa and 200 kDa were observed only after immunoprecipitation, dependening on the immunoprecipitation techniques used. The NF-L isolation was performed using two immunoprecipitation techniques, one with antibodies covalently bound to CNBr-Sepharose and other with not covalently bound to protein A/G agarose. The first technique showed less protein contamination than the other for further Mass Spectrometry analysis. Also Ga3+-column would be adequated due to the similar protein bands reactive against NF-L. The same pattern of immunoreactive bands with antibodies against NF-M observed in concentrated CSF was found after immunoprecipitation with protein A/G agarose. In summary, these results showed in CSF of TSP/HAM patients an increased level of a protein band that could be a partial degradation form of NF-L, and a decrease in the NF-L of lower molecular mass. It was not possible to determine differences in the phosphorylation levels of both groups using this immunological method. In the case of NF-M, an association between phosphorylation of threonine and serine was found, but without significant differences in the groups of study. This memory demonstrated that the NF-L immunoprecipitation with the technique where the antibodies are covalently bound to Sepharose avoid the contamination with the primary antibodies, facilitating the future proteomic analysis of these samples. With NF-M, due to its molecular mass, anyone of the immunoprecipitation techniques could be employed. On the other hand, Ga3+-chromatography requires further studies for determinating its application for phosphorylated NFs isolation.