https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/100030 Tesis Pregrado Tue, 05 May 2026 13:43:59 GMT 2026-05-05T13:43:59Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209776 Inhibición de la expresión génica, proteica y de la actividad enzimática de la salsolinol sintasa de rata mediante un shRNA in vitro Lavín Herrera, Félix Valentín El trastorno por consumo de alcohol (AUD) se asocia con la acción de metabolitos del etanol, como el salsolinol (SAL), cuyo enantiómero R ejerce efectos reforzantes en el sistema mesocorticolímbico y podría contribuir a la adicción. La salsolinol sintasa, recientemente aislada y secuenciada, es una proteína de bajo peso molecular que cataliza, en forma enantioselectiva, la conversión de dopamina (DA) y acetaldehído (ACD) en salsolinol (R-SAL), pero no existen metodologías para estudiar su expresión génica y proteica, así como su actividad enzimática. Los RNA de horquilla corta (shRNA), al degradar específicamente el RNA mensajero (mRNA), resultan ideales para validar blancos terapéuticos y emular el efecto de inhibidores farmacológicos. Por lo tanto, esta tesis tuvo como objetivo desarrollar metodologías para cuantificar la expresión génica y proteica, así como la actividad enzimática de la salsolinol sintasa en células HEK-293, y generar un shRNA dirigido a su mRNA. Se diseñó una metodología de RT-qPCR (PCR cuantitativa con transcripción inversa) capaz de detectar selectivamente el transcrito de la salsolinol sintasa. Para evaluar la actividad enzimática, se implementó un sistema de cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a detección electroquímica (HPLC-EC), que permitió separar y detectar los enantiómeros R/S-SAL. A nivel proteico, se estableció el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en tampón Tris–Tricina, para la separación de proteínas de bajo peso molecular. Paralelamente, se clonó un shRNA en el vector pLKO.3G, lo que constituye la primera construcción reportada dirigida contra el transcrito de la salsolinol sintasa. El shRNA produjo una disminución estadísticamente significativa del 17% en la expresión relativa, lo que valida su funcionalidad. Sin embargo, debido a la falta de un anticuerpo específico comercial, no fue posible cuantificar la proteína mediante Western Blot. Además, la formación de salsolinol no mostró cambios significativos en la razón R/S al emplear lisados de células que sobreexpresaban la enzima, lo que impidió detectar dicha actividad. En conjunto, estos resultados establecen un marco metodológico para estudiar la salsolinol sintasa mediante RTqPCR en modelos celulares, confirman un knockdown parcial de su expresión génica y resaltan la necesidad de optimizar sistemas de detección proteica y funcional, idealmente en líneas neuronales y mediante el desarrollo de un anticuerpo específico, para su estudio como posible blanco terapéutico en el AUD.; Alcohol use disorder (AUD) is associated with the action of ethanol metabolites such as salsolinol (SAL), whose R enantiomer exerts reinforcing effects in the mesocorticolimbic system and may contribute to addiction. The recently isolated and sequenced salsolinol synthase is a low–molecular weight protein that catalyzes, in an enantioselective manner, the conversion of dopamine (DA) and acetaldehyde (ACD) into salsolinol (R-SAL), but there are currently no methodologies to study its gene and protein expression, or its enzymatic activity. Short hairpin RNAs (shRNA), by specifically degrading messenger RNA (mRNA), are ideal tools to validate therapeutic targets and to mimic the effect of pharmacological inhibitors. Therefore, the aim of this thesis was to develop methodologies to quantify gene and protein expression, as well as the enzymatic activity of salsolinol synthase in HEK-293 cells, and to generate an shRNA directed against its mRNA. An RT-qPCR (reverse transcription quantitative PCR) methodology was designed to selectively detect the salsolinol synthase transcript. To evaluate enzymatic activity, a high-performance liquid chromatography system coupled to electrochemical detection (HPLC-EC) was implemented, which enabled the separation and detection of the R/S-SAL enantiomers. At the protein level, the use of sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in Tris–Tricine buffer was established for the separation of low– molecular weight proteins. In parallel, an shRNA was cloned into the pLKO.3G vector, representing the first reported construct directed against the salsolinol synthase transcript. The shRNA produced a statistically significant 17% decrease in relative expression, validating its functionality. However, due to the lack of a specific commercial antibody, it was not possible to quantify the protein by Western blot. In addition, salsolinol formation did not show significant changes in the R/S ratio when using lysates from cells overexpressing the enzyme, which prevented detection of this activity. Taken together, these results establish a methodological framework to study salsolinol synthase by RT-qPCR in cellular models, confirm a partial knockdown of its gene expression, and highlight the need to optimize protein and functional detection systems, ideally in neuronal cell lines and through the development of a specific antibody, in order to investigate its potential as a therapeutic target in AUD. Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209776 2025-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209775 Desarrollo de scaffolds de quinolin-2(1H)-ona con potencial inhibidor de la acetilcolinesterasa Hernández Villar, Héctor La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por un déficit en la neurotransmisión colinérgica, asociado al deterioro cognitivo. La acetilcolinesterasa (AChE) es la enzima responsable de degradar el neurotransmisor acetilcolina (ACh), por lo que su inhibición constituye una estrategia terapéutica validada para incrementar los niveles sinápticos de ACh y aliviar los síntomas. Los inhibidores de AChE actualmente en clínica presentan limitaciones, lo que motiva la búsqueda de nuevos agentes con mejor perfil farmacológico. El núcleo 2-quinolinona constituye un andamiaje privilegiado en química medicinal con diversas actividades farmacológicas reportadas, incluyendo potencial como inhibidor de AChE para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, aunque las metodologías sintéticas tradicionales presentan limitaciones como altas temperaturas, tiempos prolongados y reactivos tóxicos. En este trabajo se sintetizaron dos series de 2-quinolinonas mediante irradiación por microondas libre de disolvente catalizada por cloruro de estaño (SnCl2): la Serie A (4-metilquinolin- 2(1H)-onas sustituidas en C-6 con –H, –CH3, –OCH3 y –F) y la Serie B (4- fenilquinolin-2(1H)-onas con idénticas sustituciones). Las condiciones óptimas (SnCl2 0,1 equiv., 160 °C, 20 min, 125 W) permitieron obtener la Serie A con rendimientos del 67-80%, mientras que la Serie B presentó severas limitaciones mecanísticas presuntamente debido a la estabilización por resonancia de intermediarios acíclicos (fenil-β-enamidas), aislando solo el derivado 22b (6-metil-4- fenilquinolin-2(1H)-ona). La evaluación biológica mediante el método de Ellman mostró que los compuestos 21a (4-metilquinolin-2(1H)-ona) y 22b exhibieron los mayores porcentajes de inhibición de la AChE (59% y 47% a 2 mg/mL), con valores de IC50 de 1,02 mM y 0,82 mM respectivamente. Los estudios de acoplamiento molecular revelaron energías de unión favorables de -7,389 kcal/mol para 21a, - 6,984 kcal/mol para 22b y -5,726 kcal/mol para 21b, con interacciones claves tipo π-π con Trp84 e interacciones por puentes de hidrógeno con Glu199 e His440. La mayor potencia de 22b se atribuye a interacciones hidrofóbicas adicionales con Trp84 por el grupo fenilo en C-4. Estos resultados validan el núcleo 2-quinolinona como plataforma promisoria para el desarrollo de inhibidores de AChE, identificando relaciones estructura-actividad que orientarán futuras optimizaciones, incluyendo la sustitución del grupo fenilo por núcleos bencílicos para superar las restricciones sintéticas observadas y explorar nuevos candidatos terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer.; Alzheimer's disease (AD) is characterized by a deficit in cholinergic neurotransmission, associated with cognitive decline. Acetylcholinesterase (AChE) is the enzyme responsible for degrading the neurotransmitter acetylcholine (ACh); therefore, its inhibition constitutes a validated therapeutic strategy to increase synaptic ACh levels and alleviate symptoms. Currently used AChE inhibitors in the clinic have limitations, prompting the search for new agents with improved pharmacological profiles. The 2-quinolinone core constitutes a privileged scaffold in medicinal chemistry with various reported pharmacological activities, including potential as an AChE inhibitor for the treatment of Alzheimer's disease, although traditional synthetic methodologies have limitations such as high temperatures, long reaction times, and toxic reagents. In this work, two series of 2-quinolinones were synthesized using solvent-free microwave irradiation catalyzed by tin(II) chloride (SnCl2): Series A (4- methylquinolin-2(1H)-ones substituted at C-6 with –H, –CH3, –OCH3, and –F) and Series B (4-phenylquinolin-2(1H)-ones with identical substitutions). The optimal conditions (0.1 equiv. SnCl2, 160 °C, 20 min, 125 W) allowed the obtention of Series A with yields of 67-80%, while Series B presented severe mechanistic limitations due to resonance stabilization of acyclic intermediates (phenyl-β-enamides), isolating only derivative 22b (6-methyl-4-phenylquinolin-2(1H)-one). Biological evaluation using the Ellman method showed that compounds 21a (4-methylquinolin- 2(1H)-one) and 22b exhibited the highest percentages of AChE inhibition (59% and 47% at 2 mg/mL), with IC₅₀ values of 1.02 mM and 0.82 mM, respectively, comparable to the reference inhibitor donepezil (57% at 0.03 mg/mL; IC₅₀ = 66 μM). Molecular docking studies revealed favorable binding energies (-7.389 kcal/mol for 21a, -6.984 kcal/mol for 22b, and -5.726 kcal/mol for 21b), with key π-π interactions with Trp84 and hydrogen bonds with Glu199 and His440, where the greater potency of 22b is attributed to additional hydrophobic interactions with Trp84 due to the phenyl group at C-4. These results validate the 2-quinolinone core as a promising platform for the development of AChE inhibitors, identifying structureactivity relationships that will guide future optimizations, including the substitution of the phenyl group with benzyl motifs to overcome the synthetic restrictions observed and explore new therapeutic candidates for Alzheimer's disease. Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209775 2026-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209771 Inclusión de nuevas especies nativas y endémicas chilenas en el Listado de Plantas Tóxicas del Instituto de Salud Pública (ISP) Caro Moreira, Bastián Alfonso Los orígenes del ISP se remontan al año 1892 cuando fue creado el “Instituto de Higiene”, que en 1939 pasó a llamarse “Instituto Bacteriológico de Chile”, el cual dio paso en 1979 al “Instituto de Salud Pública de Chile” (ISP) como se le conoce hasta la fecha, el cual tiene como misión ser el organismo de referencia del estado, que promueve y protege la salud de la población, fortaleciendo el control sanitario a través de la vigilancia, autorización, fiscalización, investigación, y transferencia tecnológica. Esta memoria de título fue llevada a cabo en el ISP, en el departamento Agencia Nacional de Medicamentos (ANAMED), específicamente en la Unidad de Régimen de Control Sanitario y Medicinas Complementarias (URCS) la cual se encarga de definir el régimen que le corresponde aplicar a un determinado producto o sustancia cuando existen dudas respecto a su clasificación como alimento, medicamento, cosmético, pesticida de uso sanitario y doméstico o dispositivo médico, emitiendo una resolución de clasificación y además participa en el desarrollo de aspectos regulatorios de los productos de origen natural que involucran a las medicinas complementarias. En el año 2021 la URCS publicó en la página web del ISP el “Listado de Plantas Tóxicas para Chile” que contiene 47 especies y el listado de “Plantas y Hongos con Actividad Psicoactiva” que contiene 25 especies, con sus respectivas monografías. Estos listados contienen en su mayoría plantas introducidas y exóticas, siendo sólo 4 plantas tóxicas y 3 plantas psicoactivas nativas chilenas. Considerando a Chile como un país que se caracteriza por una alta biodiversidad nativa, dada por su geografía, se evaluó la necesidad de actualizar los listados de plantas tóxicas y psicoactivas con especies vegetales nativas y endémicas chilenas, tomando en cuenta que en la actualidad existen un total de 2.135 especies exclusivas del territorio nacional. Tomando en cuenta lo anterior, se realizó una búsqueda bibliográfica en libros de herbolaria nacional, de plantas tóxicas, de toxicología y farmacognosia, en artículos científicos acerca de fitotoxicidad, revisión de casos clínicos de intoxicaciones con especies vegetales, información acerca de caracterización y cuantificación de metabolitos tóxicos, en bases de datos de plantas nacionales e internacionales, en listados de plantas tóxicas y con restricción de uso en agencias gubernamentales internacionales. Se logró evidenciar la toxicidad de 12 especies nativas y 4 endémicas chilenas, que se incluyeron en una base de datos que contiene información detallada en cuanto a su nombres científicos y sinonimias, distribución geográfica, descripción morfológica e información toxicológica de cada especie vegetal, considerando sus partes tóxicas, metabolitos tóxicos, mecanismo de acción tóxico y casos clínicos relacionados con la planta. Esta base de datos será utilizada para la creación de nuevas monografías de las especies, que serán incluidas en los listados de plantas tóxicas y psicoactivas del ISP, además de ser una fuente de consulta sobre plantas nativas chilenas que necesite regular su uso tanto en preparaciones a base de plantas o como planta entera.; The origins of the ISP date back to 1892, when the “Institute of Hygiene” was created. In 1939, it was renamed the “Bacteriological Institute of Chile,” which later became the “Public Health Institute of Chile” (ISP) in 1979, as it is known today. Its mission is to serve as the State’s reference organization that promotes and protects the health of the population, strengthening sanitary control through surveillance, authorization, inspection, research, and technological transfer. This undergraduate thesis was carried out at the ISP, in the National Medicines Agency (ANAMED) department, specifically in the Sanitary Control Regime and Complementary Medicines Unit (URCS). This unit is responsible for determining the regulatory regime applicable to a given product or substance when there are doubts regarding its classification as a food, medicine, cosmetic, sanitary or household pesticide, or medical device, issuing a classification resolution. It also participates in the development of regulatory aspects related to natural-origin products involving complementary medicines. In 2021, the URCS published on the ISP website the “List of Toxic Plants for Chile,” which contains 47 species, and the “List of Plants and Fungi with Psychoactive Activity,” which contains 25 species, each accompanied by its respective monograph. These lists consist mostly of introduced and exotic plants, with only four toxic and three psychoactive species native to Chile. Considering Chile as a country characterized by high native biodiversity due to its geography, the need to update the lists of toxic and psychoactive plants with native and endemic Chilean species was assessed, taking into account that there are currently 2,135 species exclusive to the national territory. Based on this, a bibliographic search was conducted using national herbalism books, toxic plant references, toxicology and pharmacognosy texts, scientific articles on phytotoxicity, clinical case reports of poisonings involving plant species, information on the characterization and quantification of toxic metabolites, national and international plant databases, and lists of toxic plants and use-restricted species from international governmental agencies. Evidence of toxicity was found for 12 native and 4 endemic Chilean species, which were included in a database containing detailed information on their scientific names and synonyms, geographic distribution, morphological descriptions, and toxicological information for each plant species. This includes their toxic parts, toxic metabolites, mechanisms of toxic action, and clinical cases associated with each plant. This database will be used to develop new monographs for these species, which will be incorporated into the ISP’s lists of toxic and psychoactive plants, and will also serve as a reference source for Chilean native plants requiring regulation of their use, whether in plant-based preparations or as whole plants. Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209771 2025-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209756 Asociación entre variantes genéticas de ABCB1, SLCO1B1 y MTHFR y la incidencia de mucositis en pacientes pediátricos diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda en tratamiento con protocolo de consolidación con metotrexato en dosis alta Aracena Farías, Javiera Antonia La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna más frecuente en la población pediátrica. Durante su tratamiento, el metotrexato (MTX) en dosis altas constituye un pilar fundamental, especialmente en la etapa de consolidación; sin embargo, su uso se asocia a toxicidades relevantes, entre ellas la mucositis oral, que puede afectar la continuidad del tratamiento, prolongar la hospitalización y deteriorar la calidad de vida de los pacientes. En este contexto, la farmacogenética del MTX podría contribuir a explicar la variabilidad interindividual en la aparición de esta reacción adversa. El objetivo de este estudio fue evaluar la asociación entre las variantes genéticas rs1045642 en ABCB1, rs11045879 en SLCO1B1 y rs1801131 / rs1801133 en MTHFR con la aparición de mucositis oral en pacientes pediátricos con LLA tratados con MTX en dosis altas durante el protocolo de consolidación. Adicionalmente, se analizó la relación entre los niveles plasmáticos de MTX y la ocurrencia de mucositis. Se realizó un estudio de cohorte retrospectiva multicéntrico en 100 pacientes pediátricos diagnosticados con LLA y tratados en tres hospitales de la Región Metropolitana. La genotipificación se efectuó mediante PCR en tiempo real. La asociación entre variantes genéticas y mucositis se evaluó mediante tablas de contingencia, riesgo relativo y regresiones logísticas. Para los niveles plasmáticos de MTX se analizaron los pacientes del protocolo M, en quienes la monitorización farmacocinética era obligatoria. La incidencia de mucositis en la cohorte fue de 38%. No se observaron asociaciones estadísticamente significativas entre las variantes genéticas estudiadas y la aparición de mucositis. En contraste, los pacientes que desarrollaron mucositis presentaron niveles plasmáticos de MTX significativamente menores durante la fase de eliminación. A las 24 horas post-infusión, los niveles plasmáticos se asociaron inversamente con el riesgo de mucositis. El análisis ROC mostró una capacidad discriminativa aceptable, con un área bajo la curva de 0,716 y un punto de corte óptimo de 73,6 μmol/L, bajo el cual aumentó la probabilidad de desarrollar mucositis. Asimismo, se observaron diferencias según sexo, con concentraciones plasmáticas más altas en pacientes masculinos. En conclusión, en esta cohorte pediátrica no se evidenció una asociación significativa entre las variantes genéticas analizadas y la mucositis oral. No obstante, los niveles plasmáticos de MTX, particularmente a las 24 horas, emergen como un posible marcador predictivo de toxicidad.; Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignant neoplasm in the pediatric population. During its treatment, high-dose methotrexate (MTX) represents a fundamental therapeutic component, particularly during the consolidation phase; however, its use is associated with clinically relevant toxicities, including oral mucositis, which may compromise treatment continuity, prolong hospitalization, and negatively affect patients' quality of life. In this context, MTX pharmacogenetics may contribute to explaining the interindividual variability observed in the development of this adverse reaction. The aim of this study was to evaluate the association between the genetic variants rs1045642 in ABCB1, rs11045879 in SLCO1B1, and rs1801131/rs1801133 in MTHFR and the incidence of oral mucositis in pediatric patients with ALL treated with high-dose MTX during consolidation therapy. Additionally, the relationship between MTX plasma levels and the incidence of mucositis was analyzed. A multicenter retrospective cohort study was conducted in 100 pediatric patients diagnosed with ALL and treated at three hospitals in the Metropolitan Region. Genotyping was performed using real-time PCR. The association between genetic variants and mucositis was evaluated using contingency tables, relative risk estimates, and logistic regression analyses. MTX plasma levels were analyzed in patients treated under protocol M, in whom pharmacokinetic monitoring was mandatory. The incidence of mucositis in the cohort was 38%. No statistically significant associations were observed between the genetic variants studied and the occurrence of mucositis. In contrast, patients who developed mucositis showed significantly lower MTX plasma levels during the elimination phase. At 24 hours post-infusion, plasma MTX levels were inversely associated with the risk of mucositis. Receiver operating characteristic (ROC) analysis showed acceptable discriminative capacity, with an area under the curve of 0,716 and an optimal cutoff value of 73,6 μmol/L, below which the probability of developing mucositis increased. Additionally, sex-related differences were observed, with higher plasma concentrations in male patients. In conclusion, no significant association between the analyzed genetic variants and oral mucositis was identified in this pediatric cohort. Nevertheless, MTX plasma levels, particularly at 24 hours post-infusion, emerged as a potential predictive marker of toxicity. Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/209756 2026-01-01T00:00:00Z