https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/100002 Facultad de Ciencias 2026-05-08T06:16:56Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/210031 Evaluación circadiana de la expresión de moléculas asociadas al fenotipo agotado en bazo y linfonodo en un modelo de melanoma murino B16.F10 Cárdenas Mejías, Stephanie Alexandra El melanoma esla forma másletal de cáncer de piel y posee una gran capacidad para evadir la respuesta inmunitaria. Un mecanismo clave de esta evasión es el agotamiento de linfocitos T, estado en el que estas células pierden su capacidad citotóxica. Paralelamente, la fisiología del organismo está gobernada por los ritmos circadianos, un reloj endógeno que coordina procesos como el ciclo sueño-vigilia y la respuesta inmune. Estos ritmos son generados a nivel molecular por una red de genes reloj, y su correcta sincronización con el ciclo luz-oscuridad es fundamental, ya que su alteración (cronodisrupción)se ha asociado con un mayor riesgo y progresión del cáncer. Este seminario de título estableció una metodología para estudiar la relación entre el agotamiento linfocitario y los ritmos circadianos en un modelo murino de melanoma B16.F10. Se evaluaron curvas de crecimiento tumoral bajo tres condiciones de inóculo, determinándose que 125.000 células permiten una progresión tumoral controlada y un microambiente propicio para el estudio de la infiltración de linfocitos T CD8+. Posteriormente, se diseñaron y estandarizaron primers para qPCR, con los que se analizó la expresión de genes asociados al fenotipo exhausto en bazo y linfonodo. Aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas, se detectaron tendencias de mayor expresión de Pdcd1 y Havcr2 en bazo en el Zeitgiber Time 12 (ZT12, hora en que se apaga la luz), en comparación con los otros puntos temporales. El análisis complementario de datos de scRNA-seq de repositorios públicos reveló un aumento de expresión de Pdcd1, Havcr2, Lag-3 y Tcf7 en ZT13 respecto a los demás tiempos, destacando este último como marcador de linfocitos T progenitores agotados. La coexpresión de los receptores inhibidores PD-1, TIM-3 y LAG-3, además del factor de transcripción TCF-1, sugiere la coexistencia de poblaciones progenitoras y terminalmente agotadas al inicio de la fase actividad del ratón, fase en la que se presentan altos niveles de locomoción, vigilia, metabolismo y mayor búsqueda de alimento, que ocurre en la noche en los roedores. Por el contrario, en humanos la fase de actividad ocurre en el día, por lo que ambas especies presentan patrones de actividad invertidos, lo que implica una inversión fisiológica de los procesos, por lo que el aumento de los receptores inhibidores y Tcf7 en humano se presentaría al inicio del día (en la mañana). Sin embargo, hacen falta estudios en humanos para confirmar esta información. En conjunto, este estudio permitió estandarizar un modelo murino y protocolos de qPCR para explorar la expresión circadiana de genes asociados al agotamiento linfocitario. Si bien los resultados no fueron concluyentes por el reducido número de replicas biológicas y la alta variabilidad entre ellas, las tendencias observadas y el análisis transcriptómico complementario sugieren la existencia de ventanas temporales críticas para optimizar la inmunoterapia. Para confirmar la naturaleza circadiana de la expresión génica de las moléculas asociadas a agotamiento en linfocitos T y verificar si la ventana temporal óptima para las inmunoterapias se encuentra al inicio de la fase de actividad, será necesario aumentar el número de réplicas biológicas y/o los puntos temporales a estudiar. Asimismo, se destaca la relevancia de integrar aproximaciones transcriptómicas y proteómicas en futuros estudios.; Melanoma is the most lethal form of skin cancer and has a remarkable capacity to evade the immune response. One key mechanism of this evasion is T cell exhaustion, a state in which these cells progressively lose their cytotoxic function. At the same time, organismal physiology is governed by circadian rhythms — an endogenous clock that coordinates processes such as the sleep–wake cycle and the immune response. These rhythms are generated at the molecular level by a network of clock genes, and their proper synchronization with the light–dark cycle is essential, since disruption (chronodisruption) has been associated with increased cancer risk and progression. This work established a methodology to study the relationship between T cell exhaustion and circadian rhythms in a murine B16.F10 melanoma model. Tumor growth curves were evaluated under three inoculum conditions, showing that 125,000 cells allow for controlled tumor progression and create a microenvironment suitable for studying CD8+ T cell infiltration. Next, primers were designed and standardized for qPCR, which were used to analyze the expression of genes associated with the exhausted phenotype in spleen and lymph node. Although no statistically significant differences were observed, there were trends toward higher expression of Pdcd1 and Havcr2 in spleen at Zeitgeber Time 12 (ZT12, the time when lights turn off), compared with other time points. Complementary analysis of scRNA-seq data from public repositories revealed increased expression of Pdcd1, Havcr2, Lag3 and Tcf7 at ZT13 relative to the other times, with Tcf7 standing out as a marker of progenitor exhausted T cells. The co-expression of inhibitory receptors PD-1, TIM-3 and LAG-3, together with the transcription factor TCF-1, suggests the coexistence of progenitor and terminally exhausted populations at the onset of the mouse active phase, a period characterized by high locomotion, wakefulness, metabolic activity and increased foraging behavior (rodent night). By contrast, in humans the active phase occurs during daytime, so the species show inverted activity patterns; thus, the increase in inhibitory receptors and Tcf7 in humans would be expected at the beginning of the day (morning). However, human studies are needed to confirm this. Overall, this study standardized a murine model and qPCR protocols to explore the circadian expression of genes associated with T cell exhaustion. Although results were not conclusive due to the limited number of biological replicates and high inter-replicate variability, the observed trends and complementary transcriptomic analysis suggest the existence of critical temporal windows to optimize immunotherapy. To confirm the circadian nature of exhaustion-associated gene expression in T cells, and to verify whether the optimal time window for immunotherapies lies at the onset of the active phase, future work should increase the number of biological replicates per time point and/or include more sampling times. Additionally, integrating transcriptomic and proteomic approaches in future studies is strongly recommended. 2025-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/210030 Estableciendo la interacción de nuevos patrones moleculares asociados a daño inducibles (PiDAMPs) con receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) en células THP-1 Navarro Peña, Maximiliano Ignacio Este estudio explora la interacción entre Patrones Moleculares Asociados a Daño Inducibles Putativos (PiDAMPs) y Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs), específicamente de tipo Toll (TLRs), como parte del efecto inmunoestimulador del lisado tumoral alogénico TRIMEL, derivado de tres líneas celulares de melanoma humano (Mel1, Mel2, Mel3) sometidas a choque térmico controlado. Este tratamiento de las líneas tumorales promueve la expresión de proteínas de estrés térmico y la liberación de DAMPs, los cuales actúan como señales de activación inmunitaria en células dendríticas (DCs). Utilizando la línea monocítica humana THP-1 como modelo de DCs, se evaluó la presencia basal de diversos TLRs y se implementó un protocolo de estimulación celular con PiDAMPs seleccionados (Haptoglobina, HIST2H2AC, TDP-43, FLNC y HIST2HAA3), con el fin de estudiar sus patrones de localización subcelular y su posible co-localización con TLRs en la membrana plasmática o compartimientos intracelulares de las DCs. La inmunofluorescencia indirecta y la microscopía confocal permitieron cuantificar la intensidad y co-localización mediante coeficientes de Manders y densidad integrada normalizada. Los resultados mostraron interacciones específicas entre ciertos PiDAMPs y TLRs, destacando la fuerte co-localización entre HP y TLR-4, así como entre HIST2H2AC y TLR-4, ambas localizadas preferentemente en membrana. En contraste, no se observó co-localización significativa entre HP y TLR-2, lo que sugiere especificidad funcional. En el caso de TLRs intracelulares (TLR-3, TLR-8 y TLR-9), aunque hubo un aumento de señal tras estimulación con HP o TDP-43, no se evidenció incremento de co-localización, sugiriendo una interacción débil o no perceptible bajo las condiciones evaluadas. Este trabajo entrega evidencia experimental que respalda el rol de candidatos a DAMPs no caracterizados como potenciales coadyuvantes inmunológicos, abre nuevas hipótesis sobre la especificidad de las interacciones DAMP/PRR, y propone un enfoque metodológico aplicable a la caracterización funcional de ligandos inmunoestimuladores emergentes.; This study investigates the interaction between putative inducible Damage-Associated Molecular Patterns (PiDAMPs) and Pattern Recognition Receptors (PRRs), particularly Toll-like Receptors (TLRs), as part of the immunostimulatory effect of the allogenic tumor lysate TRIMEL, derived from three human allogenic melanoma cell lines (Mel1, Mel2, and Mel3) subjected to controlled heat shock. This treatment induces the expression of stress proteins and the release of DAMPs in tumor cell lines, which act as danger signals for the activation of dendritic cells (DCs). Using the human monocytic THP-1 cell line as a DC model, basal expression of various TLRs was assessed, and a stimulation protocol with selected PiDAMPs (Haptoglobin, HIST2H2AC, TDP-43, FLN-C, and HIST2HAA3) was applied to study their subcellular distribution and potential co-localization with TLRs in plasma membrane or intracellular compartments. Indirect immunofluorescence and confocal microscopy were used to quantify signal intensity and spatial co-localization using Manders’ coefficients and normalized integrated density per cell. The results revealed specific interactions between certain PiDAMPs and TLRs, notably strong co-localization between Haptoglobin and TLR-4, as well as HIST2H2AC and TLR-4, both of which are predominantly localized to the membrane. In contrast, no significant co-localization was observed between Haptoglobin and TLR-2, suggesting functional specificity. For intracellular TLRs (TLR-3, TLR- 8, and TLR-9), although signal intensity increased upon stimulation with HP or TDP-43, no corresponding increase in co-localization was detected, indicating a weak or imperceptible interaction under the tested conditions. This study provides experimental evidence supporting the role of PiDAMPs as potential immunological proteins, introduces new hypotheses regarding DAMP/PRR specificity, and offers a methodological framework applicable to the functional characterization of emerging immunostimulatory ligands. 2025-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/210017 Propagación y análisis de plantas de Solanum lycopersicum editadas en genes ACO2, NAC19 y NAC72 de respuesta a estrés salino Montecinos Troncoso, Javiera Belén El fruto del tomate (Solanum lycopersicum) es una baya carnosa que constituye una fuente significativa de vitamina C y carotenoides. Es la segunda hortaliza más cultivada y consumida a nivel mundial. En Chile, destaca por su alta rentabilidad tanto en consumo fresco como procesado, ocupando el tercer lugar entre los cultivos hortícolas con mayor superficie cultivada. Este cultivo presenta una sensibilidad moderada a la salinidad del suelo, uno de los principales estresores abióticos que limita la productividad y la calidad de los cultivos, generando pérdidas económicas significativas. No obstante, frente al estrés abiótico las plantas poseen mecanismos celulares y moleculares de adaptación. Entre ellos se incluye la expresión de genes que modulan la respuesta al estrés, clasificados como RP (reguladores positivos) o RN (reguladores negativos). Por ejemplo, los factores de transcripción NAC19 y NAC72 se han descrito como RP, ya que su expresión se induce bajo condiciones salinas, promoviendo la tolerancia ante estrés salino. En contraste, el gen ACO2, que codifica la enzima 1-Aminociclopropano-1-ácido carboxílico oxidasa, involucrada en el paso final de la síntesis de etileno, actúa como un RN en plantas modelo. La caracterización funcional de estos genes en tomate es una etapa clave para seleccionar variantes genéticas con mayor tolerancia a la salinidad. En este contexto, la edición genética de plantas es una estrategia ventajosa para abordar el desafío de la salinidad del suelo para el cultivo de tomate. Por ello, previo a este Seminario de Título, se realizó la transformación de tomates de la variedad Money Maker mediante la maquinaria de edición génica CRISPR/Cas9 dirigida a los genes SlNAC19, SlNAC72 y SlACO2. Así, durante el presente seminario de título se abordó la propagación in vitro y ex vitro de brotes T0, logrando establecer en tierra 18 plantas SlACO2Cr, 22 plantas SlNAC19Cr y 25 plantas SlNAC72Cr . Las líneas SlNAC19Cr presentaron una floración y fructificación tardía, mientras que en las líneas SlACO2Cr no se confirmaron eventos de edición, por lo cual las semillas T1 de ambas quedaron fuera del análisis funcional y fenológico. En contraste, el análisis molecular evidenció que la edición del gen SlNAC72Cr provocó un corrimiento en el marco de lectura en las líneas transformadas, lo que sugiere una alteración estructural en las proteínas codificadas. A partir de un ensayo de tolerancia a salinidad con plántulas T1 SlNAC72Cr, fue posible concluir que éstas mostraron mayor tolerancia al estrés salino respecto a plantas control. Con estos resultados, se sugiere que SlNAC72 actúa como RN a diferencia de lo descrito en plantas modelo y plantea que la edición dirigida de genes como SlNAC72 constituye una estrategia prometedora para mejorar la tolerancia a salinidad en tomate.; The tomato fruit (Solanum lycopersicum) is a fleshy berry that is a significant source of vitamin C and carotenoids. It is the second most widely grown and consumed vegetable worldwide. In Chile, it stands out for its high profitability in both fresh and processed consumption, ranking third among horticultural crops with the largest cultivated area. This crop is moderately sensitive to soil salinity, one of the main abiotic stressors that limits crop productivity and quality, generating significant economic losses. However, plants have cellular and molecular mechanisms to adapt to abiotic stress. These include the expression of genes that modulate the stress response, classified as positive regulators (PR) or negative regulators (NR). For example, the transcription factors NAC19 and NAC72 have been described as PR, as their expression is induced under saline conditions, promoting tolerance to salt stress. In contrast, the ACO2 gene, which encodes the enzyme 1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, involved in the final step of ethylene synthesis, acts as an NR in model plants. The functional characterization of these genes in tomatoes is a key step in selecting genetic variants with greater tolerance to salinity. In this context, plant gene editing is an advantageous strategy for addressing the challenge of soil salinity for tomato cultivation. Therefore, prior to this Thesis Seminar, tomatoes of the Money Maker variety were transformed using CRISPR/Cas9 gene editing machinery targeting the SlNAC19, SlNAC72, and SlACO2 genes. Thus, during this seminar, the in vitro and ex vitro propagation of T0 shoots was addressed, establishing 18 SlACO2Cr plants, 22 SlNAC19Cr plants and 25 plants SlNAC72Cr in soil. The SlNAC19Cr lines showed delayed flowering and fruiting, while no editing events were confirmed in the SlACO2Cr, which is why the T1 seeds of both were excluded from the functional and phenological analyses. In contrast, molecular analysis showed that editing the SlNAC72Cr gene caused a reading frame shift in the transformed lines, suggesting a structural alteration in the encoded proteins. Based on a salinity tolerance test with T1 SlNAC72Cr seedlings, it was possible to conclude that they showed greater tolerance to salt stress than control plants. These results suggest that SlNAC72Cr acts as a RN, unlike what has been described in model plants, and suggest that targeted editing of genes such as SlNAC72 is a promising strategy for improving salt tolerance in tomatoes. 2026-01-01T00:00:00Z https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/210015 Evaluación de la adherencia de aislados de Escherichia coli productora de toxina Shiga a células de la unión recto anal bovina Méndez Solar, Diego Esteban Alexis Las bacterias Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) corresponden a un grupo de cepas patógenas zoonóticas de gran relevancia para la salud pública, ya que pueden causar cuadros de diarrea severa, colitis hemorrágica y síndrome hemolítico urémico en humanos. El ganado bovino es el principal reservorio de STEC, y la unión recto-anal (RAJ) ha sido identificada como el sitio de colonización preferente en estos animales. Sin embargo, los mecanismos de adherencia de STEC a las células de la RAJ aún no han sido completamente caracterizados. Este estudio tuvo como objetivo establecer un modelo de cultivo primario de células epiteliales escamosas de la RAJ bovina y caracterizar el perfil genómico con foco en genes de adhesinas de 68 cepas STEC aisladas desde bovinos en Chile con el fin de evaluar su capacidad adherente. Se lograron establecer cultivos primarios de células RAJ viables hasta por cinco semanas. Además, se identificaron genes de virulencia mediante el análisis de secuenciación de genomas completos, así como sus serotipos, siendo O130:H11 el más frecuente en la colección. Las cepas presentaron una alta diversidad genética, con la presencia de genes que codifican para adhesinas clave como fimH y lpfA, además de genes para la producción de toxina Shiga, siendo stx2 el tipo más detectado. No fue posible evaluar los patrones de adherencia de STEC debido a dificultades técnicas como la falta de adherencia del tipo celular, lo que llevó a la identificación de puntos críticos en el protocolo. Se propusieron mejoras metodológicas al protocolo, que permitan la consecución del objetivo próximamente. Los resultados de este estudio contribuyen al estudio con la epidemiología molecular de STEC y aportan al desarrollo de análisis de la adherencia bacteriana, sentando las bases para futuros estudios que impliquen el cultivo de células de la RAJ bovina y/o que permitan dilucidar los mecanismos de adherencia bacteriana y su relación con la patogenicidad de STEC.; Shiga toxin-producing Escherichia coli bacteria (STEC) are zoonotic pathogens of high public health relevance, as they can cause severe diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome in humans. Cattle are the main reservoir of STEC, and the recto-anal junction (RAJ) has been identified as the principal site of colonization in these animals. However, the mechanisms of STEC adhesion to RAJ cells have not yet been fully characterized. This study aimed to establish a primary culture model of bovine RAJ squamous epithelial cells and to characterize the genomic profile of 68 STEC strains isolated from cattle in Chile to evaluate their adherent capacity. We were able to establish viable primary cultures of RAJ cells up to five weeks. In addition, virulence genes were identified by whole genome sequencing analysis, as well as their serotypes, being O130:H11 the most frequent in the prevalent collection. The strains showed high genetic diversity, with the presence of genes encoding for key adhesins such as fimH and lpfA, together with genes for Shiga toxin production, with stx2 as the most frequent type. It was not possible to evaluate STEC adhesion patterns due to technical difficulties such as lack of adherence, by the cell type which led to the identification of critical points in the protocol. Methodological improvements to the protocol were proposed, which will allow the achievement of the objective in the near future. The results of this study contribute to the understanding of the molecular epidemiology of STEC, support the development of bacterial adhesion analyses, laying the foundations for future studies involving bovine RAJ cell cultures and/or elucidating the mechanisms of bacterial adhesion and their relationship with STEC pathogenicity. 2025-01-01T00:00:00Z