Identificación y clonación de glicosil hidrolasas para uso en producción de bioetanol

Abstract

La hidrólisis de celulosa a azúcares fermentables es una de las etapas clave que deben ser optimizadas para disminuir el costo de producción de bioetanol producido a partir de lignocelulosa, materia prima abundantemente disponible en Chile en desechos agrícolas y forestales. La hidrólisis de celulosa es catalizada por enzimas celulasas, pertenecientes al grupo de las glicosil hidrolasas.

Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la identificación y clonación de glicosil hidrolasas, con énfasis en enzimas potencialmente útiles en procesos de producción de bioetanol. La estrategia general de trabajo consistió en la identificación y selección de cepas capaces de degradar celulosa cristalina, a las cuales se dirigió un método de obtención de fragmentos de DNA codificantes de glicosil hidrolasas, enfocado a la actividad exoglucanasa.

Un análisis in sílico de la secuencia de los fragmentos de DNA obtenidos indicó que se obtuvieron fragmentos de genes con actividades putativas β-1,3(4)-glucanasa y α-glucosidasa provenientes de cepas de Lentinula edodes y Peniophora gigantea, respectivamente. Estos resultados poseen altos niveles de confianza (con e-values del orden de 10-9 y 10-30, respectivamente). El fragmento correspondiente a la β-1,3(4)-glucanasa contiene el dominio catalítico conservado característico de este tipo de enzimas. Se estima que los fragmentos encontrados representan un 38% de una β-1,3(4)-glucanasa y un 12% de una α-glucosidasa.

El método también produjo la obtención de fragmentos de DNA que codificarían enzimas con otras actividades no relacionadas con glicosil hidrolasas, específicamente una transcriptasa reversa y un transportador de urea.

Las enzimas β-1,3(4)-glucanasas y α-glucosidasas son potencialmente aplicables en la etapa de pretratamiento de lignocelulosa en la producción de bioetanol de segunda generación y en la etapa de degradación de almidón en la producción de bioetanol de primera generación, respectivamente, entre otras aplicaciones industriales de menor interés para este trabajo.

En conclusión, se logró clonar fragmentos de dos glicosil hidrolasas potencialmente aplicables en un proceso de producción de bioetanol. La estrategia utilizada deberá ser perfeccionada para hacerla más específica, logrando el diseño de partidores degenerados más específicos o bien considerando una estrategia global alternativa, tal como utilizar una genoteca de cDNA como templado del método en lugar de DNA genómico.