| Abstract | dc.description.abstract | El avance en la investigación en terapia génica durante los últimos años ha generado interés en la construcción y producción de vectores virales, siendo actualmente los adenovirus los más utilizados en ensayos clínicos de terapia génica. Para satisfacer la demanda de estos vectores, es necesaria su producción a gran escala. Debido a esto, la caracterización del crecimiento de las células de riñón de embrión humano (HEK293) es de gran importancia para la identificación de factores que permitan la optimización de las condiciones de producción y una mejora en el rendimiento en la producción de adenovirus.
En este trabajo se realizó una comparación del estado metabólico y del nivel de proteínas para cultivos de células HEK293 durante el crecimiento y producción de adenovirus.
Se determinaron los parámetros de crecimiento para células creciendo adheridas en medio suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y para células adaptadas a crecer en un medio bajo en suero, suplementado con 0,5% de SFB, 40 [mg/L] de albúmina de suero bovino (BSA) e intralípidos al 0,01 [%v/v]. Las células adaptadas a crecer en el medio bajo en suero alcanzaron una concentración celular de 2x106 [cel/mL], comparable al caso base, logrando un crecimiento uniforme usando placas cebadas. En el caso de células creciendo adheridas, se observó que al consumirse completamente la glucosa éstas comenzaban a consumir lactato como fuente alternativa de carbono. Esto significó una extensión en la mantención del cultivo tanto en medio bajo en suero como en medio suplementado con 10% de SFB.
Se adaptaron células a crecer en suspensión en spinners con medio bajo en suero suplementado con Pluronic F-68 y antiaglomerante, alcanzando una concentración de 1x106 [cel/mL]. Esta concentración es un 48% inferior a la obtenida creciendo adheridas, presentando además tasas de consumo de glucosa y producción de lactato un 71% y 76% menores, respectivamente.
Durante la producción de adenovirus se registraron mayores tasas de consumo de glucosa y producción de lactato que las alcanzadas en el crecimiento, sin presentar un aumento de biomasa. Esto indica un cambio en el metabolismo celular durante la producción de adenovirus. Al mismo tiempo se observó una disminución de la viabilidad celular producto de la acción lítica del adenovirus. La mayor producción de virus se alcanzó en células creciendo adheridas en medio con 10% de SFB con un título de 1,6x1013 [pfu/mL] a las 48 [hpi].
A través de un ensayo de ELISA intracelular se cuantificaron enzimas claves del metabolismo del carbono, siendo las enzimas estudiadas: Fosfofructoquinasa (PFK), Piruvato deshidrogenasa (PDH), Lactato deshidrogenasa (LDH), y α-Ketoglutarato deshidrogenasa (α-KGD). Se comparó la cantidad de enzimas entre células creciendo en medio suplementado con 10% y 0,5% de SFB, tanto para el estado de crecimiento como para la producción de adenovirus. Se obtuvo diferencias significativas sólo en caso de la LDH, siendo el nivel de esta enzima mayor durante el crecimiento en el cultivo suplementado con 10% de SFB, siendo también el nivel de LDH mayor en la producción de adenovirus en comparación al crecimiento con 0,5% de SFB. Estos resultados fueron contrastados con los obtenidos a través del Análisis de Flujo Metabólico (MFA), para las vías en que participan dichas enzimas, encontrando una concordancia en el comportamiento en las condiciones comparadas, ya que el aumento en la producción de lactato en el crecimiento en medio con 10% de SFB responde a una mayor cantidad de LDH. En la producción de adenovirus el aumento del lactato sería producto de la lisis celular y no de un aumento de la LDH.
Finalmente los resultados obtenidos permitirán un mejor entendimiento del comportamiento de células HEK293, y de sus requerimientos nutricionales en cultivo y producción de adenovirus. | |
