Expresión recombinante de una endoglucanasa del hongo Trametes versicolor en Pichia pastoris

Abstract

Existe una preocupación mundial por la disponibilidad de los combustibles fósiles para suplir la demanda de energía en el mundo, que aumenta año a año, y los problemas ambientales que su uso genera. Así, el bioetanol lignocelulósico ha surgido como una adecuada alternativa para reemplazar parcialmente la gasolina, pero todavía su costo no es competitivo con el petróleo o gasolina. El proceso de producción de bioetanol consta de tres etapas principales: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. Específicamente, la hidrólisis es catalizada por celulasas y es una de las etapas con grandes proyecciones a disminuir su costo, por lo que este trabajo se enfoca en esta etapa, principalmente en el desarrollo de nuevas celulasas, que puedan aportar al desarrollo actual y a lograr reducir el costo de producción del bioetanol. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar el gen que codifica para una endoglucanasa del hongo Trametes versicolor y expresar la enzima en el sistema de expresión de Pichia pastoris. A partir de dos fragmentos de la secuencia del gen, se obtuvo una secuencia con el dominio catalítico completo, llamada tveg. La secuencia se clonó en el vector pPICZαA y se transformó células de la cepa GS115 de P. patoris para expresar la proteína en forma extracelular. Luego se realizó una curva de inducción y se estudió la expresión de la enzima en la fracción extracelular e intracelular. El análisis de la expresión se realizó mediante ensayos de actividad sobre carboximetilcelulosa (CMC) en medio sólido y en medio líquido, zimogramas y geles SDS-PAGE. El análisis de tveg mediante BLASTX mostró, con un 90% de identidad, que corresponde a la secuencia de una endoglucanasa del hongo T. versicolor, perteneciente a la familia 5 de las glicosil hidrolasas. Los ensayos en medio sólido revelaron actividad enzimática en la cepa recombinante GS115, indicando que la expresión fue exitosa. Por otra parte, los ensayos en medio líquido de la cepa GS115-TvEG permitieron cuantificar la actividad de la endoglucanasa TvEG recombinante, produciendo 8,3 U/l de cultivo a las 84 horas de inducción con metanol, de las cuales un 50% se encontraba en la fracción extracelular y un 50% en la fracción citoplasmática. Los zimogramas corroboraron los resultados de los ensayos en medio líquido y en los geles SDS-PAGE se vio una proteína con un peso molecular aparente de 90 kDa, mucho mayor a los 30 kDa estimados para TvEG, posiblemente por hiperglicosilación y/o problemas de corte de la señal de secreción. Por otro lado, se estudió la producción de celulasas nativas del hongo T. veriscolor en Avicel, CMC y astillas de Lenga como fuente de carbono. Con CMC se logró mayor producción de actividad celulolítica, llegando a un máximo de 225 U/l a los 6 días de cultivo. La gran diferencia entre el sistema nativo y el sistema recombinante, y la comparación con otros estudios, indican que la expresión de TvEG debe y puede ser mejorada.