Evaluación de la suplementación del medio de cultivo con piruvato sobre la maduración In Vitro de ovocitos caninos

Abstract

En el presente trabajo, se estudiaron los efectos de la suplementación con piruvato al medio de cultivo y del tiempo de incubación (72-96 h) sobre el desarrollo meiótico de ovocitos caninos. Los ovocitos utilizados se obtuvieron de ovarios de perras ovariohisterectomizadas, los que fueron liberados mediante cortes finos con hojas de disección, recolectándose bajo lupa estereoscópica. Se seleccionaron aquellos ovocitos de mayor tamaño, que presentaban citoplasma homogéneo y al menos dos capas de células del cúmulo, lavándose dos veces en medio PBS para posteriormente incubarlos en grupos de 8 a 10 ovocitos en gotas de 100 μL, bajo aceite mineral estéril. Se utilizó un medio de maduración A (control), preparado en base a TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de gonadotrofina coriónica humana, 12 mg/mL de penicilina y 20 mg/mL de estreptomicina; y el medio de maduración B, que correspondió al medio control más la suplementación de 11,2 mg/mL de ácido pirúvico. Los ovocitos incubados en ambos medios se cultivaron por periodos de 72 y 96 horas a 38,5 ºC, en una atmósfera de 5% de CO2 y 98% de humedad. Luego de cada periodo de incubación, los ovocitos se fijaron en una solución de ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2 v/v) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3 v/v) por 72 horas a 4º C. Los ovocitos fijados se tiñeron con 0,1% de ioduro de propídeo (PI) y se evaluaron bajo microscopia de epifluorecencia. Los distintos estados de desarrollo meiótico fueron clasificados como: estado de vesícula germinativa (GV), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). Se realizaron 9 réplicas experimentales. Para el análisis de los resultados los porcentajes fueron transformados: arc-sen √% y evaluados por ANDEVA. Los promedios fueron comparados a través de la prueba de Tukey. 7 Diferencias de p≤ 0,05 fueron consideradas significativas. Tanto a las 72 como a las 96 horas de cultivo el porcentaje de ovocitos que se mantuvieron arrestados al estado de vesícula germinativa, sin progresar en la meiosis, fue significativamente mayor (P≤ 0,05) en el medio control, que en el medio suplementado con piruvato. Por otra parte, la proporción de gametos en reinicio meiótico y primera metafase no varió en los distintos sistemas de cultivo, mientras que la maduración nuclear completa alcanzando el estado de segunda metafase (MII) fue favorecida por la presencia de ácido pirúvico en el medio (P≤ 0,05). No se observaron diferencias significativas asociadas al efecto del tiempo de incubación (72 y 96 horas) sobre los distintos estados de maduración nuclear en ninguno de los medios de cultivo. Los resultados muestran que la suplementación con piruvato mejora las tasas de maduración in vitro de ovocitos de perra y que la prolongación del tiempo de incubación no influye significativamente en el efecto que tiene el piruvato sobre el desarrollo nuclear de los ovocitos caninos madurados en cultivo