Análisis de dos isoformas de la proteína quinasa CK1 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La proteína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas (α, β, δ, ε, γ-1, γ-2 y γ-3). En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1α y CK1ε en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridización in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1α se detecta desde la primera hora post fertilización y presenta un patrón de expresión ubicuo en los primeros estadíos para luego restringirse a la región cefálica y a las aletas pectorales, mientras que CK1ε no presenta un componente materno y el mRNA cigótico es detectado después de las 12 horas post fertilización con un patrón de expresión restringido exclusivamente al cerebro. Para analizar la función de ambas isoformas se realizaron estudios de sobrexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1α y CK1ε y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección de las dominantes negativas de cada isoforma. Para CK1α también se utilizó la inyección del morfolino oligo antientido que silencia específicamente la actividad de éste gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores en embriones inyectados con el Morfolino Anti CK1α, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podría estar involucrada esta ultima isoforma. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1α, a diferencia de CK1ε, está involucrada en los procesos que regulan la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente en las que se encuentran ubicadas en el límite entre cerebro medio y posterior (cerebelo y cuarto ventrículo). En cambio, CK1ε solo tendría participación en la formación de estructuras cerebrales sin afectar la formación de los ejes en el embrión en desarrollo