Evaluación de la presencia de acrosina en espermatozoides frescos de perro sometidos a capacitación in vitro

Abstract

Existe poca información en espermatozoides caninos sobre la dinámica y factores que influyen sobre la capacitación espermática y la reacción del acrosoma (RA), procesos fundamentales para una exitosa fecundación. Con el fin de implementar biotecnologías reproductivas más avanzadas, se hace imperativo profundizar los conocimientos sobre estos procesos espermáticos. El objetivo de este estudio fue inmunolocalizar, por inmunofluorescencia indirecta, la enzima acrosina en espermatozoides caninos eyaculados capacitados in vitro, con el propósito de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de esta enzima durante la reacción del acrosoma. Se recolectó la fracción espermática de un total de 5 eyaculados, a partir de 3 perros adultos. Cada muestra fue una réplica experimental, evaluándose en cada una la concentración espermática y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides eyaculados fueron capacitados en medio de capacitación canino (CCM) en diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2 y 3 horas) y temperaturas de incubación (20°C y 37°C). Cada muestra espermática fue evaluada en las diferentes condiciones de tiempo y temperatura de incubación en su motilidad progresiva y procesada para inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y, luego, un anticuerpo secundario antiratón fluorescente, mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot 2). La presencia de acrosina se determinó en base a la marca fluorescente a nivel acrosomal, clasificándose en dos patrones de inmunomarcaje: a. sin marca fluorescente o nulos y b. con marca fluorescente o marcados, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los patrones de inmunomarcaje fueron analizados mediante regresión logística y la motilidad progresiva a través de análisis de varianza, en ambos casos, diferencias de p≤0,05 se consideraron significativas. El porcentaje de espermatozoides sin marca fluorescente o nulos fue aumentando (p<0,0001) a través del tiempo de incubación desde 13,9 % a la hora 0, a 35,7 % y 32,1 % a las 3 horas de incubación, a 20°C y 37°C, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre las temperaturas de incubación (p>0,05). La MP, evaluada subjetivamente mediante microscopía de contraste de fases, indicativa de la viabilidad espermática, fue disminuyendo (p≤ 0,05) a medida que transcurrió el tiempo de incubación, desde un 81% en la hora 0, a un 50% a 20°C y a un 53% a 37°C, a las hora 3 de incubación, sin existir diferencias significativas entre ambas temperaturas de incubación. Los resultados obtenidos permiten concluir que la liberación de acrosina en los espermatozoides caninos eyaculados sometidos a capacitación in vitro es afectada por el tiempo de incubación e independiente de la temperatura de capacitación. Del mismo modo, la motilidad espermática se vio influenciada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación. Por primera vez, fue posible determinar el curso del tiempo de capacitación en el espermatozoide fresco de perro, mediante la inmunolocalización de la acrosina, pudiendo ser los cambios en los patrones de inmunomarcaje el reflejo de cambios en la reacción acrosomal de los espermatozoides