Determinación del gen UL37 del virus herpes canino mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

Abstract

En Chile, el virus herpes canino (CaHV-1) se ha detectado mediante técnicas clásicas de virología como aislamiento en cultivos celulares y posterior citólisis de las células afectadas, mediante inmunofluorescencia, por la presencia de cuerpos de inclusión o mediante estudios de cinética viral, lo cual ha permitido completar el análisis biológico de un aislado nacional denominado RP5. En contraste, en el presente trabajo se realizó la detección molecular del gen UL37 de CaHV-1, gen que codifica para la proteína UL37, presente en el tegumento del virus y que participa del ciclo replicativo viral. Para tal efecto, se utilizaron 6 inóculos virales obtenidos de sobrenadantes de cultivos celulares de la línea MDCK infectados con RP5. Para el PCR se utilizaron los partidores CHV-1: 5’-AAGAGCTCGTGTTAGTGAAAAT 3´ y CHV-2: 5’-TAAACCCGCTGGA TGATAC- 3’ (Erles et al., 2004). La visualización del amplicón se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. La electroforesis se llevó a cabo a 90 volts por 90 minutos. Como marcador de tamaño molecular se utilizó un estándar que contiene fragmentos de ADN entre 100 y 1000 pb. Luego de la electroforesis, el gel se incubó en bromuro de etidio (0,5 μg/ml), posteriormente lavado, colocado en un transiluminador de luz ultravioleta y finalmente fotografiado. Todos los sobrenadantes de cultivos celulares utilizados resultaron positivos al PCR descrito, observándose una banda de alrededor de 500 pb, lo cual concuerda con lo descrito en la literatura al utilizar esta metodología. Para tener una aproximación de la sensibilidad de la técnica empleada, se realizaron diluciones al décimo (10-1-10-8) del inóculo viral RP5 (DICT50 = 1,58 x 106/mL) y se determinó la dilución a la cual el PCR descrito no detectó el gen de la proteína UL37. Así, siete de las ocho diluciones resultaron positivas al PCR, observándose una banda de alrededor de 500 pb. Lo anterior indica que este método permitiría detectar hasta 0,00079 DICT50, lo que comparado con las 100DICT50 que se requieren para lograr la infección en células, sugiere una alta sensibilidad asociada al PCR. El producto amplificado fue purificado, secuenciado y se determinó el porcentaje de identidad nucleotidica respecto a un fragmento del gen de la UL37 de virus herpes canino (GenBank accession number AY582738). Así, se determinó que entre la secuencia del GenBank y la secuencia de consenso del amplificado nacional existe un 94% de identidad nucleotídica. Adicionalmente, se comparó la secuencia obtenida con las de otras seis secuencias del gen UL37 presentes en cepas de herpes virus existentes en el Genbank y no se estableció un porcentaje de identidad mayor al obtenido respecto de las secuencias comparadas, lo cual sugiere que la secuencia obtenida en esta memoria de título pertenece al CaHV1. Así, podemos concluir que esta metodología permite la detección de un amplicón de ADN con características compatibles con las descritas para el gen de la proteína UL37 del CaHV-1 mediante una herramienta molecular que cumple con las características del diagnóstico actual: rápido, sensible, específico y de bajo costo. Lo anterior, sin duda, permitirá contribuir para resolver un problema existente en los planteles reproductores caninos, al tener la posibilidad de ofrecer la detección del CaHV1 en pequeños animales como mascotas de compañía, un área de sostenido crecimiento