Identificación de proacrosina/acrosina por Western Blot en espermatozoides caninos refrigerados y capacitados in vitro en distintos tiempos

Abstract

La inseminación artificial con espermatozoides refrigerados es empleada en varias especies animales incluidos los perros, sin embargo, aunque en menor grado que la congelación, la refrigeración tiene efectos detrimentales sobre el espermatozoide pudiendo afectar procesos como la capacitación espermática y reacción acrosómica, donde se libera el sistema enzimático proacrosina/acrosina. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante Western Blot en espermatozoides de perro sometidos a refrigeración, la reactividad del sistema proacrosina/acrosina durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se utilizaron 7 eyaculados de 3 perros adultos. En cada muestra se evaluó la concentración espermática y la motilidad progresiva. Los espermatozoides de cada eyaculado fueron procesados como muestras frescas y refrigeradas. Los espermatozoides frescos fueron resuspendidos en medio Fert Talp en cantidad suficiente para lograr una concentración de 5 x 106 espermatozoides/mL y los que se refrigeraron, se resuspendieron en diluyente en base a TRIS en proporción 2:1 (TRIS-semen), yema de huevo, ácido cítrico, fructosa y antibióticos, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 200 x 106 espermatozoides/mL, manteniéndolos a 4 ºC por 24 horas. Tanto los espermatozoides frescos (control) como los refrigerados/entibiados, se incubaron en medio de cultivo Fert Talp por periodos de 0 a 3 h para inducir la capacitación espermática. Posterior a cada tiempo de incubación los espermatozoides fueron sometidos a extracción proteica, las que fueron separadas utilizando electroforesis. Luego, a través de Western Blot, las proteínas en estudio se incubaron con el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10, en donde se observaron bandas correspondientes a proacrosina y las formas activas -acrosina y β-acrosina en cada tiempo de capacitación espermática en los espermatozoides caninos frescos y en los refrigerados. La densidad óptica de las bandas se analizó mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey. Los resultados en espermatozoides frescos mostraron que tanto proacrosina como la forma activa -acrosina no cambiaron en forma significativa durante los diferentes tiempos de incubación, sin embargo, β-acrosina presentó una mayor actividad a partir de la 2 h de incubación (p < 0,05). En espermatozoides refrigerados, la reactividad con el anticuerpo, de proacrosina como tampoco las de sus formas activas  y β, mostró diferencias significativas durante los diferentes periodos. Sin embargo, al comparar la reactividad presentada por proacrosina,  y β-acrosina entre espermatozoides frescos y aquellos sometidos a refrigeración, proacrosina no presentó diferencias significativas entre ambos tratamientos. Se obtuvieron valores mayores (p  0,05) de densidad óptica de -acrosina en espermatozoides refrigerados, a partir de las 3 horas de incubación. En relación a β-acrosina, se pudo observar una mayor reactividad de esta molécula con el anticuerpo al inicio del período de capacitación, en espermatozoides refrigerados en comparación a los frescos. A partir de la segunda hora de capacitación in vitro, no se observaron diferencias significativas en la detección de - acrosina entre estos tipos de espermatozoides. En conclusión, los espermatozoides caninos refrigerados, presentaron una activación más temprana de proacrosina hacia su forma activa β-acrosina, en comparación con los espermatozoides caninos frescos, durante la incubación para capacitación a que fueron sometidos