Clonamiento, expresión y purificación de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas TcAP1 y TcAP2 de Trypanosoma cruzi en condiciones nativas

Abstract

El agente causal de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es de carácter endémico en América Latina; se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en cuatro formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, tripomastigote metacíclico y tripomastigote sanguíneo, formas no replicativas e infectivas y amastigote, forma intracelular replicativa. T. cruzi es capaz de sobrevivir al daño oxidativo del DNA generado por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) producidas por su propio metabolismo, así como aquellas producidas en el intestino del insecto vector y en células del hospedero mamífero. Este daño sería reparado mediante la actividad de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP) de la vía de escisión de bases (BER). T. cruzi presenta en su genoma secuencias que codificarían para endonucleasas AP, entre ellas TcAP1, homóloga de APE1 humana y TcAP2, homóloga de APE2 humana y de Apn2 de Schizosaccaromyces pombe. La expresión de estas proteínas podría ser fundamental para la sobrevida del parásito, tanto en el vector triatomino como en el hospedero mamífero. Para un estudio sistemático de las características de estas enzimas, se requiere obtenerlas en el más alto grado de pureza desde el parásito o por técnicas de ingeniería genética. En esta Memoria de Título se clonaron las secuencias génicas que codifican para TcAP1 y TcAP2 en vectores de expresión para células eucariontes, lo que se confirmó mediante secuenciación automática de DNA. Con estos constructos se transfectaron células S2 de Drosophila melanogaster, levaduras Pichia pastoris y epimastigotes de T. cruzi cepa Dm28c. Sorprendentemente, sólo fue posible expresar ambas endonucleasas en este último modelo. La imposibilidad de expresar ambas endonucleasas AP en los modelos P. pastoris y D. melanogaster podría relacionarse a una variedad insuficiente o limitada de ciertos tRNAs, necesarios para la expresión de TcAP1 y TcAP2, con la consecuente disminución de la traducción de los mRNAs codificantes para ambos genes. Probablemente, los tRNAs que presentan anticodones específicos para la traducción de las endonucleasas AP de T. cruzi sólo se encuentran en concentraciones adecuadas en modelos celulares de expresión filogenéticamente cercanos a este protozoario. Mediante cromatografía de afinidad se intentó purificar TcAP1-GFP a partir de homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes transfectados que expresaban esta proteína recombinante. Sin embargo no se logró obtener la proteína recombinante en condiciones nativas de forma pura. Se concluye que la utilización de GFP asociado como proteína de fusión a TcAP1 sólo permite la identificación de la proteína recombinante y no una purificación adecuada de la misma