Búsqueda de enzimas LPMO de hongos para la producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico

Abstract

La sociedad se enfrenta de forma cada vez más fehaciente y cercana a una crisis del modelo energético actual. El uso indiscriminado de combustibles fósiles, y los problemas medioambientales que su uso acarrea han llevado lentamente hacia un cambio de paradigma. Una de las alternativas renovables al uso de estos es la producción de bioetanol a partir de desechos lignocelulósicos. Este proceso, aunque prometedor, presenta problemas en la eficiencia de las etapas de pretratamiento y de hidrólisis, que no le permiten afianzarse en el mercado energético. En la búsqueda de soluciones, se ha apuntado en los últimos años a las proteínas de hongos capaces de degradar la madera para su consumo. Entre estas, las monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMO) han cobrado gran importancia en el último tiempo. Estas son parte importante del proceso de despolimerización de la celulosa, y su capacidad de aumentar la eficiencia de éste las han puesto en el centro de atención. Este trabajo de tesis tiene como objetivo la búsqueda de nuevas LPMOs desde dos hongos: Fusarium oxysporum y Gloeophyllum trabeum. Más específicamente, se buscó identificar enzimas de interés en el secretoma del hongo y secuenciarlas para su posterior análisis in silico. Estos objetivos se desarrollaron en una primera instancia a través de la búsqueda de medios de cultivo que indujeran la producción de celulasas por parte de los hongos. A partir de la biomasa producida en los cultivos se realizó una extracción de RNA, para luego transcribir el mRNA a cDNA. El cDNA fue utilizado en reacciones de PCR con partidores degenerados. Esto tuvo como fin identificar LPMOs de entre las proteínas transcritas por el hongo. Los genes identificados fueron amplificados usando partidores específicos, y transformados en E. coli unidos a vectores de clonación. Finalmente los genes fueron secuenciados y esta información se utilizó para analizar in silico las propiedades de las LPMOs codificadas por los genes clonados. Se pudo determinar durante el trabajo medios idóneos para la inducción de la producción de celulasas, y se tuvo la oportunidad de mejorar el proceso de extracción de RNA desde hongos. Del proceso de secuenciación se obtuvo las secuencias de un gen perteneciente a G. trabeum y de dos genes pertenecientes a F. oxysporum. Se observó que las proteínas que estos codifican poseen los componentes estructurales descritos como indispensables para ser enzimas activas, vale decir las dos histidinas y la tirosina que forman el sitio activo; se estableció el mapa de restricción de los genes, y se realizó un análisis filogenético de estos en relación a proteínas de referencia. Del análisis de las secuencias obtenidas se determinó que, según la clasificación vigente, serían parte de la subfamilia 3 de las LPMOs. Finalmente, se pudo aproximar mediante herramientas computacionales la estructura tridimensional de estas proteínas. Se observó que la estructura predicha sigue los patrones que presentan las LPMOs ya caracterizadas, otro indicador de que se podría tratar de enzimas funcionales. En conclusión, se puede decir que se cumplieron los objetivos propuestos en este trabajo. Se logró identificar y secuenciar dos LPMOs expresadas por F. oxysporum y una por G. trabeum. Asimismo, se logró realizar un análisis en profundidad de las secuencias utilizadas. Este permite suponer que se trata efectivamente de proteínas con el potencial de mejorar el proceso de producción de biocombustibles, y que se debiese seguir al siguiente paso lógico, que correspondería al análisis de la funcionalidad de la proteína nativa o expresada en forma heteróloga, y su rol en la degradación de lignocelulosa.