Fecundación in vitro en caninos: evaluación de la penetración espermática en el tiempo utilizando semen fresco y refrigerado con ovocitos en diferentes estados de maduración

Abstract

En este trabajo se investigó mediante fecundación in vitro, la capacidad de espermatozoides caninos refrigerados a 4 °C y frescos (controles), de atravesar la ZP, y penetrar el citoplasma ovular, de ovocitos de perra en estado inmaduro y madurados in vitro, a través de diferentes tiempos de coincubación gamética. Se trabajó con eyaculados de 5 perros adultos, el semen se obtuvo por estimulación digital, utilizando la segunda fracción espermática. Luego de la evaluación del semen, se retiró el plasma seminal por centrifugación, los espermatozoides utilizados como controles (frescos) fueron resuspendidos en medio Fert TALP y los espermatozoides que se sometieron a refrigeración se resuspendieron en extensor o diluyente en base a TRIS-yema de huevo-ácido cítrico y fueron posteriormente refrigerados a 4 °C, por 24 horas. Posterior a ese tiempo, se retiró el diluyente por centrifugación y el pellet espermático fue resuspendido en medio Fert TALP. Ambos tipos de espermatozoides -frescos y refrigerados- fueron coincubados con ovocitos de perra tanto inmaduros como madurados in vitro, en forma separada. Los ovocitos utilizados provinieron de ovarios macerados, obtenidos previamente por ovariectomía. Los ovocitos fueron seleccionados bajo la lupa estereoscópica y lavados en PBS. Posteriormente, los utilizados en estado inmaduro se ambientaron en medio de coincubación Fert TALP y luego se coincubaron con espermatozoides frescos o refrigerados. Los ovocitos que se sometieron a maduración in vitro fueron incubados en medio TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de hCG, 2.5 μl/mL de solución piruvato y 5 μl/mL de solución antibiótica por 72 y 96 horas. Posteriormente fueron coincubados separadamente con ambos tipos de espermatozoides. La coincubación gamética se realizó por períodos de 1 a 10 horas en medio Fert TALP. Cada hora de incubación se retiraron ovocitos, se fijaron en una solución en base a ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3) por 72 horas a 4 °C y teñidas con 0,1% de Yoduro de Propidio para la 4 posterior evaluación de la penetración espermática y fecundación en microscopia de epifluorecencia. Un ovocito penetrado se determinó cuando se encontró espermatozoides en zona pelúcida (ZP), en espacio perivitelino (PV) o en el citoplasma ovular (C). Se utilizó análisis de varianza y de regresión para determinar diferencias en los diferentes parámetros estudiados. Se evaluaron un total de 3391 ovocitos inmaduros (n= 1765) y madurados in vitro (n= 1626). La penetración espermática fue directamente proporcional al tiempo de coincubación. El aumento del porcentaje de penetración total con espermatozoides frescos fue significativo a partir de las 3 horas en ovocitos inmaduros y 2 horas en ovocitos madurados in vitro (p< 0,05). Con espermatozoides refrigerados, los ovocitos inmaduros muestran diferencias en la penetración total a partir de las 5 horas de coincubación, en ovocitos madurados in vitro es posible observar diferencias a partir de las 2 horas. Los mayores porcentajes de penetración total se obtuvieron a partir de las 6 y 7 horas de coincubación y hacia finales del cultivo. Los espermatozoides refrigerados tuvieron un menor porcentaje de penetración que los frescos, durante todo el periodo de cultivo, excepto a la primera hora de coincubación con ovocitos madurados in vitro y espermatozoides refrigerados (p<0,05). Los ovocitos madurados in vitro fueron penetrados en mayor proporción que los inmaduros (p< 0,05), considerando todo el periodo de cultivo. Se concluye que al aumentar el tiempo de cultivo, un mayor número espermatozoides logró atravesar las cubiertas ovocitarias. Los ovocitos inmaduros y madurados in vitro son penetrados en mayor porcentaje por espermatozoides frescos respecto a aquellos refrigerados, sin embargo, los espermatozoides sometidos a refrigeración serían capaces de penetrar antes los ovocitos madurados in vitro. No obstante los ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro pueden ser penetrados por espermatozoides caninos frescos y refrigerados, la utilización de ovocitos madurados sería más apropiado para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos y criopreservados.