Caracterización molecular de Cryptosporidium parvum aislado en bovinos con diarrea neonatal en dos regiones de Chile usando el gen gp60

Abstract

La diarrea neonatal bovina provocada por Cryptosporidium parvum, es una enfermedad parasitaria que produce grandes pérdidas económicas en los rebaños lecheros del mundo. Su principal signo es la presentación de diarrea en bovinos neonatales. menores a 30 días de edad y se caracteriza a una profusa eliminación de ooquistes. El descubrimiento del gen que traduce para la glicoproteína de 60 kDa (gp60) de C. parvum que posee dentro de su genoma un segmento polimórfico hipervariable de codones que traducen para el aminoácido serina, ha servido para el desarrollo de herramientas de epidemiologia molecular por su utilidad para caracterizar distintas subpoblaciones a través de la caracterización de distintos subtipos. En Chile no existen investigaciones basadas en esta glicoproteína y por lo tanto resultó interesante para este trabajo, determinar el o los subtipos presentes en una muestra de heces de bovinos neonatales que presentaron diarrea. Se utilizaron 36 muestras de heces pertenecientes a dos regiones biogeográfica del país: Región Metropolitana (RM) y Región de Los Ríos (RR); previamente diagnósticas como positivas a Cryptosporidium spp mediante tinción de Zielh-Neelsen modificado (ZNm). Las muestras presentaban distinto grado de parasitosis y fueron sometidas a una prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional (PCR) del gen SSU 18S rDNA (18S) para confirmar su positividad. Veinte y nueve (29/36) muestras resultaron positivas a 18S. Las muestras negativas fueron sometidas a una PCR control de amplificación que resultó en la presencia de 5/7 muestras no amplificadas. Las 29 muestras positivas a 18S fueron sometidas a una PCR para amplificar un fragmento del gen gp60, la cual resultó en 15/29 muestras positivas a este gen. Los amplicones producidos en la PCR gp60, fueron secuenciados y analizados mediante programas bioinformáticos. La caracterización molecular dio como resultado la presencia de un reducido número de subtipos de C. parvum: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). La presencia del subtipo IIaA15G2R1 concuerda con la literatura internacional en ser el mayormente representado, siendo el único subtipo presente en las muestras de la RR y estar presente en 3/5 de las muestras de la RM. El subtipo IIaA17G2R1 solo ha sido 13 mencionado en dos oportunidades en la literatura internacional en bovinos neonatales, haciendo que esta descripción sea la tercera a nivel mundial. El subtipo IIaA17G4R1 solo ha sido descrito en humanos en la literatura revisada y, por lo tanto, este trabajo haría su primera descripción en bovinos neonatales. Ambos subtipos solo se presentaron en la RM (2/5). Además este estudio confirma la utilidad de la técnica de ZNm al ser más sensible que la PCR 18S en detectar la presencia de Cryptosporidium spp. El presente trabajo fue el primero en determinar el subtipo de C. parvum mediante el secuenciamiento de fragmentos de gp60 en el país y caracterización molecular a través de técnicas bioinformáticas.

Neonatal calf diarrhea caused by Cryptosporidium parvum, it is a parasitic disease that produce mayor economic loses in worldwide dairy herds. The principal sign is diarrhea in preweaned calves accompanied with profuse oocyst shedding. The discovering of the gene that traduce for the 60 kDa glycoprotein of C. parvum which have a polymorphic hypervariable serine codon fragment, has served for the development of molecular epidemiology tools because the utility in the characterization of subpopulations using different subtypes. There are not such investigations in Chile based in this gene and that was interesting for the author of this work to determine different subtype presents in a small sample of feces from neonatal calves. Using 36 samples from two biogeographical districts: Región Metropolitana (RM) and Región de Los Ríos (RR), previously modified Ziehl Neelsen (mZN) positive, distinct parasitic level was present in the samples and a conventional SSU 18S rDNA (18S) Polymerase Chain Reaction (PCR) was made to confirm Cryptosporidium spp. Twenty nine (29/36) samples was 18S positive. Negative samples was submitted to PCR amplification control that turned out in 5/7 not amplified samples. 18S positive samples, was submitted to gp60 PCR that result in 15/29 positive samples. Amplicons produced, were sequenced and analyzed by bioinformatics suites. Molecular characterization of the amplicons shows a reduced number of C. parvum subtypes in the samples: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). Presence of the IIaA15G2R1 subtype it is accord with de international scientific communications, the most representative C. parvum subtype. This was confirming in RR, which was the unique subtype describe and in RM was present in 3/5 samples. Subtype IIaA17G2R1 only has mentioned twice in neonatal calf, turning this investigation in the third description of the subtype worldwide. Subtype IIaA17G4R1 only been divulgated once in humans, therefore, this investigation would be the first characterization in bovines worldwide. Both subtype was presents in RM but not in RR. Further, this scientific work confirms the utility of mZN over 18S in terms of sensibility. This actual investigation was the first in it type 15 to characterize C. parvum subtypes in Chile by the sequencing and analyzing of gp60 gene fragments amplicons.