Implementación de la técnica de la reacción de la polimerasa en cadena como método diagnóstico de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae y su aplicación en muestras de gallinas comerciales en Chile

Abstract

Mycoplasma gallisepticum (MG) y Mycoplasma synoviae (MS) son patógenos que afectan el sistema respiratorio de las aves de producción y pueden ser transmitidos verticalmente a la progenie. Ambos forman parte de la lista de enfermedades de denuncia obligatoria a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). La medida más efectiva para controlar la enfermedad, ha sido por muchos años la erradicación mediante la mantención de abuelas y reproductoras libres de la infección, generando una progenie libre de MG y MS. En Chile, el diagnóstico de la micoplasmosis en planteles avícolas es realizado mediante técnicas serológicas capaces de detectar anticuerpos contra MG y MS, utilizando las técnicas de enzimoinmunoensayo (ELISA) e inhibición de la hemoaglutinación (IHA). Además se utiliza la técnica de cultivo y aislamiento bacteriano. Estas pruebas son utilizadas en el Programa de Control de Mycoplasma sp. dirigido a los distintos estratos de aves, pertenecientes a empresas avícolas productoras de carne de pollo, carne de pavo y de huevos de mesa. Al ser MG y MS patógenos de denuncia obligatoria, se vuelve de suma importancia implementar nuevas técnicas de laboratorio capaces de brindar resultados fidedignos y en tiempos acotados. Con el propósito de que, de existir un brote de la enfermedad, se pueda poner en marcha rápidamente las medidas de control propuestas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG). La técnica de la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), desarrollada más recientemente, ha sido introducida en los laboratorios de diagnóstico de Chile y de otros países como una herramienta útil para analizar el estado sanitario de las aves de corral, principalmente, para confirmar los resultados positivos expresados por las pruebas de ELISA e IHA. La PCR es capaz de identificar el DNA específico de MG y MS, de forma rápida y certera. En el siguiente estudio, se buscó implementar un protocolo de PCR en cepas de referencia de MG y MS en un laboratorio de diagnóstico autorizado por el SAG y participante del programa oficial de control de Mycoplasma sp. y posteriormente, puesto a prueba en muestras de campo. Las muestras recolectadas para poner a prueba el protocolo de PCR, fueron tomadas en una población de gallinas de postura comerciales, clínica y productivamente sanas, pertenecientes a un plantel de aves serológicamente positivas a MG y MS mediante la prueba de ELISA. Para cumplir con el propósito del estudio, se realizó un paso de extracción y purificación del DNA genómico. A continuación se realizó la PCR con partidores diseñados para amplificar un fragmento de la secuencia del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S de ambos patógenos. Posteriormente, se realizó la electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa al 2%, a 80 Voltios durante 40 minutos. Finalmente, se visualizaron las bandas de amplificación en un transiluminador UV, dejando registro fotográfico de las imágenes. El protocolo de PCR puesto en marcha demostró la capacidad de amplificar el DNA de las cepas de referencia, así como el DNA de MG y de MS presente en las muestras de campo.

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are two important pathogens that cause infections of the respiratory system of poultry. Also, they can be transmitted vertically to the progeny. Both are part of the reportable list of diseases to the World Organization for Animal Health (OIE). For many years, the main and most effective measure to control the disease has been the eradication of infection by maintaining batches of Grandparent lines and Parent Stock free of infection and thus generating a progeny free of MG and MS. The diagnosis of avian mycoplasmosis in poultry in Chile, is performed by serological methods capable of detecting antibodies against MG and MS, using the techniques of Immuno-Assays (ELISA) and hemagglutination inhibition (HI). Also, by employing cell culture and bacterial isolation. These tests are used as a part of the Mycoplasma sp. Control Program and are aimed at different types of birds of the Chilean Poultry Industry such as meat chicken, meat turkey and table eggs. Since MG and MS are pathogens notifiable to the OIE, it is very important to implement new laboratory techniques that are capable of providing reliable and fast results. In order to, in the case of an outbreak of the disease, begin as soon as possible with the control measures proposed by the Agriculture and Livestock Service. Developed more recently, the assay of Polymerase Chain Reaction (PCR) has been introduced in diagnostic laboratories of Chile and other countries as a useful tool for analyzing the health status of batches of poultry, and mainly, to confirm positive results expressed by the ELISA and HI. PCR test, is able to identify the specific DNA sequences of MG and MS, rapidly and accurately. In this study, we first implemented a PCR protocol with reference strains of MG and MS in a diagnostic laboratory authorized by the SAG and participant of the official program control Mycoplasma sp. and then we tested it with field samples. Tracheal swabs samples were collected, processed and tested with PCR protocol implemented. The samples were taken from a commercial population of laying hens, clinically and productively healthy, from a farm that was serologically positive to MG and MS by ELISA. To fulfill the purpose of this study, a preliminary step to extract and purify the genomic DNA was made. Then PCR was performed with primers designed to a fragment of the gene sequence coding for 16S ribosomal RNA of both pathogens. Subsequently, we performed 2% agarose gel electrophoresis, where the PCR products were subjected to a potential difference of 80 volts, for 40 minutes. We finally visualized the amplification bands on a UV lamp and kept photographic records. The protocol implemented demonstrated the ability to amplify DNA from both reference strains, as well as the DNA present in field samples for PCR of MG and MS.