Calreticulina (CRT) en el líquido sinovial de la articulación radio carpal clínicamente sana de equinos

Abstract

El objetivo planteado para esta tesis fue investigar la presencia de la proteína Calreticulina en el líquido sinovial de la articulación radio carpal de equinos Fina Sangre Inglés, mediante métodos moleculares y de esta manera describir una proteína que hasta la fecha no se ha identificado en la especie equina. Para lo anterior, se utilizaron 5 equinos clínicamente sanos, desde los cuales se obtuvo una muestra de líquido sinovial para su posterior estudio. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida que se analizó mediante inmuno electro transferencia (IWB) utilizando anticuerpos anti Calreticulina humana (HuCRT) y anti Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), permitiendo un reconocimiento antigénico de la proteína. Se utilizó HuCRT y TcCRT como control (+). Adicionalmente, se estudió la capacidad in vitro de la Calreticulina presente en el líquido sinovial para unirse a C1q del sistema de complemento, lo cual fue estudiado mediante inmuno electro transferencia. También, se efectuaron ensayos con el objetivo de modificar el patrón electroforético de las proteínas del líquido sinovial equino para disminuir la concentración de las proteínas más abundantes, y con ello aumentar relativamente las proteínas que se encuentran en menor concentración. Finalmente, se realizó una espectrometría de masas (MALDI-TOF) y una espectroscopia de Raman con el objeto de identificar y confirmar que la proteína inmuno reactiva fuese CRT. En la IWB se evidenció una reacción positiva por la aparición de una banda de aproximadamente 50 kDa la cual fue evidenciada con el anticuerpo anti HuCRT. El desafío a C1q no generó una reacción positiva, no pudiendo evidenciarse la unión de CRT del líquido sinovial equino al componente C1q del complemento. La presencia de la proteína CRT en el líquido sinovial equino, utilizando el diseño experimental planteado, no pudo ser confirmada por espectrometría de masas como por espectroscopía de Raman, necesitándose diseñar otros experimentos para separar y aislar más específicamente la proteína en estudio. La Calreticulina equina (EqCRT) fue reconocida principalmente por el anticuerpo anti HuCRT y no así por el anticuerpo anti TcCRT, lo que se debe probablemente a una mayor homología entre ambas proteínas a diferencia de la proteína del equino con la proteína de Trypanosoma cruzi. Por otro lado, el que no hubiese reacción al realizar el desafío frente a C1q, no quiere decir que la “EqCRT” no se una a C1q y puede haber sido más que nada un problema de diseño experimental en donde se utilizaron concentraciones muy bajas de proteína, no logrando producir una reacción identificable mediante el IWB. Para lograr una correcta identificación de la CRT mediante espectrometría de masas, se requiere obtener una muestra más purificada y de esta manera evitar el reconocimiento de otras proteínas contaminantes. Por otro lado, la espectroscopía de Raman, con la longitud de onda utilizada (785 nm), no fue posible identificar un espectro específico que pudiese confirmar la presencia de CRT en el líquido sinovial equino de animales clínicamente sanos. Con la información obtenida en este estudio, es posible suponer que la CRT puede estar cumpliendo algún rol en la homeostasis articular, sin embargo, otros experimentos son necesarios para lograr su completa identificación.

The goal for this research was to investigate the presence of Calreticulin in the equine synovial fluid obtained from the radio carpal joint of Thoroughbred horses and thus describe a protein that has not been identified in this specie so far. Five clinically healthy horses were selected and a synovial fluid sample was obtained from each one. Synovial fluid samples obtained were analyzed by a polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting using anti Trypanosoma cruzi Calreticulin (TcCRT) and anti Human Calreticulin (HuCRT) antibodies, allowing an antigenic recognition of the protein. TcCRT and HuCRT served as positive controls. Additionally, challenge between the equine synovial fluid and C1q of the human complement system was studied by western blot. Also, a combinatorial peptide ligand library technology assay was performed to deplete high concentration proteins, like albumin, which can mask and difficult the access to low concentration proteins. The aforementioned assay changed the synovial fluid electrophoretic pattern. Finally, the immunoreactive protein was studied by MALDI-TOF mass spectrometry and Raman spectroscopy. The western blot demonstrated a positive reaction that allowed detection of a band of 50 kDa when anti HuCRT antibody was used. The challenge to C1q did not generate a positive reaction evidencing a failed binding between EqCRT from synovial fluid with human C1q. The presence of CRT in the equine synovial fluid could not be confirmed by both mass spectrometry and Raman spectroscopy using the experimental design proposed for this study thus further investigation is required to fully identify the protein in the equine synovial fluid. The EqCRT was only recognized by anti HuCRT antibody, which was probably due to higher homology between the human and equine proteins. On the other hand, no reaction was evidenced when the EqCRT was challenged against C1q, nevertheless, that is attributable to an experimental design problem in which very low concentrations of protein were used so the western blot was not able to generate a detectable signal. Due to experimental design, it was not possible to fully confirm the presence of the protein in the equine synovial fluid from clinically healthy animals using Mass spectrometry and Raman spectroscopy. However, the information gathered in this study imply that CRT may be present in the synovial fluid of horses and it might be a protein involved in the homeostasis of joints but further investigation is required.