Producción de ácido pirúvico y gliceraldehído a partir de alginato mediante inmovilización enzimática en superficie celular

Abstract

Los procesos biotecnológicos industriales utilizan diversas azúcares simples como fuente de carbono y energía para sus procesos. La mayor parte de estas provienen desde fuentes agrícolas, lo que conlleva a un impacto ambiental negativo en cuanto al: uso de suelos arables/deforestación, agua dulce, agroquímicos y sus respectivos impactos derivados. El alginato, obtenido desde maroalgas, se presenta como una interesante alternativa por cuanto su producción evita la mayor parte de estos impactos negativos. Sin embargo, la utilización directa de alginato como fuente de carbono por parte de la mayor parte de los microorganismos de uso industrial se ve imposibilitada por cuanto estos prescinden de la ruta metabólica necesaria para su degradación e incorporación al metabolismo central. El presente trabajo propone un proceso biotecnológico capaz de realizar la bio-conversión de alginato a ácido pirúvico y gliceraldehído, productos que pueden ser utilizados directamente como fuente de carbono por diversos microorganismos en reemplazo de las fuentes comunes. La ruta de conversión consiste en cuatro enzimas de proceso: una endo-alginato liasa (ALY), una exo-alginato liasa (OAL), una aldosa reductasa (DEHR) y una glucanato aldolasa (KDGA). Estas cuatro enzimas fueron obtenidas desde diversos recursos genéticos y expresadas en forma soluble intracelular. La actividad específica sobre su respectivo sustrato fue demostrada para estas enzimas, a excepción de DEHR para la que no se cuenta con un método de determinación de actividad. La proteína del antígeno 43 (Ag43) es un autotransportador nativo de Escherichia coli. Ag43 produce la exposición de un dominio de la proteína (PD) sobre la membrana celular externa, pero anclada a la célula mediante un dominio de translocación (TU). Mediante herramientas de ingeniería genética es posible intercambiar el PD por diversas proteínas, entre ellas enzimas, dando lugar a los denominados catalizadores de célula completa. Con el fin de evitar la necesidad de transporte de sustratos y productos a través de la membrana celular, para impedir que el ácido pirúvico producido sea consumido y para permitir la recuperación del poder enzimático, se propone que las cuatro enzimas de proceso (ALY, OAL, DEHR, KDGA) sean fusionadas a Ag43 en reemplazo de PD. Para validar el funcionamiento de este sistema de inmovilización basado en Ag43, una proteína fluorescente (EGFP) fue intercambiada por el dominio PD. Con la utilización de tripsina para la liberación de la proteína fluorescente acoplada a Ag43, se pudo demostrar que el sistema basado en Ag43 permite exponer en forma correcta las proteínas en la membrana celular externa. Todas las enzimas de proceso fusionadas a Ag43 fueron expresadas correctamente, sin embargo, para ninguna de ellas se pudo demostrar actividad específica sobre su respectivo sustrato. Todos los ensambles genéticos desarrollados en este trabajo se realizaron mediante Gibson Asembly. Un programa computacional para el diseño específico de partidores para esta técnica fue desarrollado.