Aislamiento y purificación de membranas apicales y basales de trofoblasto equino (Equus caballus)

Abstract

La placenta es el principal órgano de intercambio de nutrientes y productos de desecho entre la madre y el feto. De su normal desarrollo y funcionamiento depende el éxito de la gestación. Si bien la placenta puede considerarse fundamentalmente similar a otros epitelios como el intestinal y renal, ésta presenta algunas características anatómicas e histológicas sinciciales que la diferencian de otros epitelios. Se estandarizó un protocolo de aislamiento de membranas apicales y basales de trofoblasto equino, a partir de una misma placenta en forma simultánea. Esto minimiza las variaciones intrínsecas debido al origen diverso de las membranas analizadas. Las placentas se obtuvieron del Haras Fina Sangre de Carrera (“El Sheik” y “Santa Eladia”, ambos ubicados en la Región Metropolitana). Inmediatamente después, se realizó la purificación de la membrana apical y basal de trofoblasto equino, mediante un método que incluyó centrifugaciones diferenciales, precipitación de membranas con cloruro de magnesio y purificación de membranas utilizando gradiente de sacarosa. La calidad, en cuanto a pureza, se determinó con marcadores bioquímicos específicos tanto de membrana apical y basal Se trabajó con un total de ocho placentas. El tejido fue sometido a dos procedimientos alternativos procesando la membrana corioalantoidea por corte (I) (n=5) o raspado (II) (n=3). En ambos casos las muestras fueron tomadas de las zonas cercanas al cordón umbilical, las que presentaron mayor desarrollo microcotiledonario. El rendimiento de la preparación en términos de recuperación de proteínas obtenidas por (I) y (II), fue para la fracción microsomal apical (fma) de 1,22 % ± 0,10 y de 4,34 % ± 0,73, respectivamente; en tanto que para la fracción microsomal basal (fmb) fue de 0,47% ± 0,13 y 1,65% ± 0,29. El rendimiento de las fracciones puras apicales (PA) fue de 0,046% ± 0,04 y de 0,18% ± 0,01, en tanto el rendimiento de la fracción basal pura (PB) fue de 0,081% ± 0,01 y 0,073% ± 0,01, respectivamente. A fin de asegurar la pureza de las vesículas obtenidas, se midió la actividad enzimática de marcadores específicos para la membrana apical y basal del trofoblasto equino (fosfatasa alcalina y unión de ligandos específicos a receptores -adrenérgicos), respectivamente. La actividad específica de fosfatasa alcalina (UI/ mg prot) se midió por un método comercial, con valores para la fracción microsomal apical (fma) obtenida por (I) y (II), de 80,8 ± 18,05 (I) y de 159,04 ± 15,5 (II). En tanto, para la fracción microsomal basal (fmb) los valores obtenidos fueron 19,7 ± 5,0 (I) y 30,7 ± 3,1 (II), respectivamente. La actividad de fosfatasa alcalina de las fracciones pura apical (PA) que se obtuvo por cortado y raspado fue de 91 ± 6, (I) y 174 ± 8,2 (II), en tanto que la fracción pura basal (PB) arrojó los valores de 15 ± 1,5 y 12 ± 0,1 respectivamente. En tanto el enriquecimiento de la fracción pura apical (PA) que se obtuvo fue de 4,6 ± 0,1 y 5,0 ± 0,1 veces, y para la fracción pura basal (PB) los valores de enriquecimiento fueron de 0,8 ± 0,01 y 0,3 ± 0,05 veces respectivamente. La unión de dihidroalprenolol tritiado a receptores β-adrenérgicos no arrojó un resultado concluyente respecto a la distribución diferencial de dicho marcador en las membranas apical y basal purificadas. Sin embargo, la escasa contaminación de la membrana basal con fosfatasa alcalina es un buen indicador de la calidad de dichas membranas y de la eficiencia del gradiente de sacarosa utilizado para purificar la fracción microsomal basal. Estos datos indican que el rendimiento del método de purificación por raspado es mayor que cuando el procesamiento del tejido se realiza inicialmente por cortado. La actividad y el enriquecimiento de fosfatasa alcalina también respaldan esta conclusión. Con el desarrollo de este método de purificación se ha dado un primer paso para la obtención de membranas apicales y basales de placentas de tipo epiteliocorial, lo que permitirá, posteriormente, aplicar el protocolo de aislamiento en placentas de camélidos sudamericanos, cuyas características fisiológicas son relevantes para el estudio de gestaciones bajo condiciones de hipoxia.

The placenta is the main organ of exchange of nutrients and waste products between the mother and the fetus in mammalian species. Although the placental epithelium can be considered fundamentally similar to other epithelia, it displays particular anatomical and histological characteristics in both the human and equine placenta, such as its syncytitial nature. The study of transport functions between mother and fetus in these cases necessarily involves the study of such functions in the polarized apical (mother-facing) and basal (fetal-facing) plasma membranes. In this study, a protocol for simultaneous apical and basal membrane isolation in equine trophoblast was standardized. A total of n=8 placentas were obtained from two Thoroughbred Race Horse Haras (El Sheik and Santa Eladia, both located in the Metropolitan Region of Chile). Immediately after birth, the equine placenta was transported to the laboratory on ice to begin the purification protocol, which included two alternative methods for tissue collection followed by differential centrifugations, precipitation of basal membranes with magnesium chloride, and membrane purification using sucrose gradients. Initial tissue collection was done either by chopping the placental tissue (villous tissue adhered to chorioallanthoid membrane) in small pieces (method I; n=5) or by scraping the villous tissue from the chorioallanthoid membrane (method II; n=3). Specific biochemical markers for apical and basal membranes were used to determine purified fraction purity and contamination. The yield of the preparation in terms of protein recovery obtained by method I and method II for the apical microsomal fraction (fma) was of 1.22%±0.10 and 4.34%±0.73, respectively, whereas for the basal microsomal fraction (fmb) the yield was of 0,47% ±0.13 and 1.65%±0.29, respectively. The protein recovery for the purified apical fraction (PA) for method I and method II was of 0.046%± 0,04 and 0.18%± 0,01, respectively, whereas the protein recovery for the purified basal fraction (PB) was of 0.081%± 0,01 and 0,073% ±0.01, respectively. Specific markers for apical membrane (enzymatic activity of alkaline phosphatase) and basal membrane (substrate binding to -adrenergic receptors) of trophoblast were measured in both the apical and basal fractions to determine their degree of purity and cross-contamination. Measurements of specific activity for alkaline phosphatase (UI/mg prot) were of 80.8± 18,05 for method I and 159.04±15.5 for method II in the apical microsomal fraction (fma), and of 19.7±5.0 for method I and 30,7 ± 3,1 for method II in the basal microsomal fraction (fmb). Alkaline phosphatase activity in the purified apical fraction (PA) was of 91 ± 6,3 for method I and 174 ±8.2 for method II, whereas in the purified basal fraction (PB) values were of 15 ±1.5 for method I and 12 ±0.1 for method II. Enrichment of alkaline phosphatase activity in the PA fraction was of 4,6 ±0.1 fold for method I and 5.0±0.fold 1 for method II, and of 0.8±0.01 fold for method I and 0,3 ±0.05 fold for method II in the PB fraction. Substrate binding to β-adrenergic receptors did not show conclusive results with respect to the differential distribution of this marker in purified apical and basal membranes. Nevertheless, the little contamination of the basal membrane with alkaline phosphatase is a good indicator of the quality of these purified membranes. The exposed data indicate more efficient membrane purification when using method II than when using method I. The activity and the enrichment of alkaline phosphatase also endorse this conclusion. The development of this method of simultaneous isolation of apical and basal trophoblast plasma membranes is a first approximation for the study of transport functions in placentas of the epitheliocorial type. This may allow, in the future, the use of such protocol in placentas of South American camelids, whose physiological characteristics are excellent for the study of gestations under conditions of hypoxia