Estudio y modificación de enterobacter aerogenes mediante ingeniería genética: análisis de las vías para la producción de hidrógeno

Abstract

La enorme demanda energética que es necesaria para satisfacer las necesidades socio-económicas tanto en Chile como a nivel mundial ha planteado un gran desafío debido a que la principal fuente para la generación de energía proviene de los combustibles de origen fósil, que además de estar agotándose han generado un gran impacto ambiental. Esto a llevando a la búsqueda de nuevas formas energéticas. Entre estas, el hidrógeno molecular (H2) producido por medios biológicos es considerada la forma de energía más prometedora, económica y con menor impacto ambiental. Se han reportado varias bacterias mesófilas capaces de realizar este tipo de proceso, entre ellas se encuentra Escherichia coli, Clostridium sp. y Enterobacter sp. Si bien la producción de bioH2 es la más prometedora y sustentable, el rendimiento de este proceso es bajo debido principalmente a la producción de otros metabolitos celulares en perjuicio de la generación de bioH2. De las bacterias mesófilas capaces de producir bioH2 , la especie E. aerogenes ha sido una de las más estudiadas y se ha utilizado recientemente como modelo de estudio para producción de diversos compuestos o moléculas de importancia industrial y científica. Esta bacteria es capaz de generar bioH2 a través de dos vías: i) a través de la vía del formato, la cual presenta un rendimiento teórico de 2 moles de H2 por mol de sustrato y ii) la vía del NADH, que tiene un rendimiento teórico de 4 moles de H2 por mol de sustrato. Sin embargo, estas vías no están estudiadas ni caracterizadas en su totalidad en E. aerogenes y poco se sabe de su mecanismo de reacción o los genes relacionados. En esta tesis se examinó la presencia de las vías de producción de bioH2 en una cepa de E. aerogenes, denominada en nuestro laboratorio como 2F. La aproximación bioinformática realizada con el genoma de la cepa comercial KCTC 2190 demostró que esta cepa de E. aerogenes posee una [Ni-Fe]-hidrogenasa representada por la hidrogenasa-3 (Hyd-3) presente en el complejo proteico Formato Hidrógeno Liasa (FHL) encargada de generar bioH2 por la vía del formato. Junto con lo anterior, la búsqueda experimental con partidores que poseen ambigüedad nucleotídica sugiere que Hyd-3 es la única hidrogenasa presente en la cepa E. aerogenes de nuestro laboratorio, no encontrando evidencia de la existencia de otras [Ni-Fe]-hidrogenasas así como de [Fe-Fe]- hidrogenasas. Las fermentaciones realizadas con E. aerogenes 2F demuestran que el complejo proteico FHL es el principal encargado de la generación de bioH2 a través de la vía del formato, logrando una producción de 2.66 mmol de H2 por peso seco de células. Junto con lo anterior, se justifica la existencia de otro tipo de hidrogenasa independiente de formato, que no mostraría relación con el aumento de NADH intracelular. Por otro lado, el análisis de los resultados de las mutaciones, cuyo objetivo era aumentar los niveles de NADH, demuestran que su aumento produce un incremento en la producción de bioH2 sugiriendo una relación no descrita hasta el momento entre NADH y Hyd-3 (3.69 mmoles de bioH2 por gramo de célula). El análisis del balance energético y de carbonos junto con la reconstrucción de las vías metabólicas centrales muestran que el desbalance energético, generado por la eliminación de genes, promueve la activación de otras vías celulares con el objetivo de restaurar este desbalance. De esta forma se produce una activación de vías anapleróticas y el incremento en la producción principalmente de acetato y etanol (0.31 y 1.67 moles de metabolito por mol de glucosa, respectivamente). El estudio realizado con hidrolizado de paja de trigo, como sustrato renovable primario, demuestra que con el uso de pretratamientos alcalinos de 1 % y 2 % de NaOH, junto con el alcalino con peróxido de hidrógeno (H2O2 ) al 1.5 % se obtienen los mejores rendimiento de mmoles de bioH2 por gramo de célula (3.06, 2.97, 2.50, respectivamente).