Evaluación de polisacáridos capsulares, de la formación de biofilm y de la invasión celular en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de vacas con mastitis persistentes y transitorias

Abstract

La mastitis bovina es la enfermedad de mayor prevalencia en la industria lechera y la de mayor importancia, ya que provoca enormes pérdidas económicas que oscilan entre el 30 y el 70% de las pérdidas totales. El principal problema a nivel productivo está representado por la mastitis subclínica, la cual tiende a la persistencia o cronicidad, y a ser refractaria a tratamiento antibiótico. Este tipo de mastitis es comúnmente causado por Staphylococcus aureus y suele ser la forma de presentación más frecuente en los planteles lecheros a nivel mundial. El objetivo de esta tesis fue determinar diferencias entre cepas de S. aureus provenientes de vacas con mastitis persistentes y de vacas con mastitis transitorias respecto a su capacidad de formación de biofilm e invasión celular, y a su genotipificación capsular. Para ello, se seleccionaron aislados provenientes de mastitis bovinas persistentes y transitorias, que fueron caracterizados según su perfil de resistencia a antibióticos y tipificados mediante la técnica de Electroforesis en Campo Pulsado (Pulsed-Field). Se evaluó in vitro la formación de biofilm en placas de 96 pocillos y la invasión celular con células MAC-T. La genotipificación capsular (cap5-cap8) de las cepas se llevó a cabo mediante técnica de PCR. Además, mediante esta misma técnica se realizó la detección de los genes implicados en la formación de biofilm e invasión celular (operón icaADBC, bap, fnbA, fnbB). Se lograron identificar aislados de S. aureus persistentes y transitorios (n=30) en la glándula mamaria bovina mediante PFGE. Dichos aislados se agruparon en diferentes pulsotipos, demostrando una elevada diversidad genética, y en general fueron sensibles a todos los antibióticos ensayados (n=12), incluída la meticilina. El gen cap5 fue el de mayor frecuencia, pesquisándose en todas las cepas provenientes de vacas con mastitis persistentes y en una cepa proveniente de una vaca con mastitis transitoria; el resto de las cepas fueron “no tipificables”. Todas las cepas analizadas fueron capaces de formar biofilm, sin embargo, las cepas de S. aureus provenientes de vacas con mastitis persistentes formaron mayor cantidad de biofilm que las cepas de S. aureus provenientes de vacas con mastitis transitorias. En paralelo, todas las cepas fueron capaces de invadir células MAC-T, sin embargo, esta última capacidad fue baja en general y no se asoció con la manifestación de la mastitis o con el origen de las cepas (cepas provenientes de vacas con mastitis persistentes o mastitis transitorias). En conclusión, las cepas de S. aureus provenientes de vacas con mastitis persistentes codificaron en su genoma el gen cap5 y formaron mayor cantidad de biofilm que las cepas de S. aureus provenientes de vacas con mastitis transitorias

Bovine mastitis is the most prevalent and important disease in the dairy industry, since it causes huge economic losses ranging among 30 and 70% of total losses. The main problem at the production level is represented by subclinical mastitis, which tends to persistence or chronicity and to be refractory to antibiotic treatment. This type of mastitis is commonly caused by Staphylococcus aureus and is usually the most frequent form of presentation in dairy farms in the world. The aim of this thesis was to determine differences between strains of S. aureus from cows with persistent mastitis and cows with transient mastitis respect to their biofilm formation capacity, cell invasion capacity, and their capsular genotyping. isolates from persistent and transient bovine mastitis were selected and characterized according to their antibiotic resistance profile and typified by the Pulsed-Field technique. The formation of biofilm in 96 well plates and the cellular invasion with MAC-T cells were evaluated. Capsular genotyping (cap5-cap8) of the strains was carried out by PCR technique. In addition, the detection of the genes involved in the formation of biofilm and cellular invasion (operon icaADBC, bap, fnbA, fnbB) was carried out using the same technique. It was possible to identify persistent and transient S. aureus isolates (n=30) in the bovine mammary gland using the Pulsed-Field technique. Those isolates were grouped into different pulsotypes showing a high genetic diversity, and in general were sensitive to all antibiotics tested (n=12), including methicillin. The cap5 gene was the most frequent, being identified in all strains from cows with persistent mastitis and in one strain from a cow with transient mastitis; the rest of the strains were "non-typeable". All the strains were able to form biofilm, however, strains of S. aureus from cows with persistent mastitis formed more biofilm than strains of S. aureus from cows with transient mastitis. In parallel, all the strains were able to invade MAC-T cells, however, this last capacity was low in general and was not associated with the manifestation of mastitis or with the origin of the strains (strains from cows with persistent mastitis or transient mastitis). In conclusion, S. aureus strains from cows with persistent mastitis encoded the cap5 gene in their genome and formed more biofilm than S. aureus strains from cows with transient mastitis