Análisis de las isoformas 1 Y 2 de la proteína quinasa CK1 en eventos relacionados con el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La proteína CK1 es una familia de proteínas quinasa a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para esto, analizamos los patrones de expresión de estos genes mediante RT-PCR e hibridización in situ. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera similar en cuanto a su temporalidad, ya que ambas se detectan desde la primera hora post fecundación (h.p.f). CK1δ1 presenta un patrón ubicuo hasta las 8 h.p.f y limitándose después al sistema nervioso central. Por su parte, la expresión de CK1δ2 presenta ubicuidad hasta las 24 h.p.f, restringiéndose posteriormente a la zona cefálica y al primordio de las aletas pectorales. Para analizar la función de ambas isoformas se efectuaron estudios de sobre expresión, mediante la inyección en embriones de pez cebra de los mRNAs codificante para CK1δ1 y CK1δ2, y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección en embriones de los mRNA de las formas Dominantes Negativas de cada uno de los genes estudiados. Estos experimentos se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula y posteriormente incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores específicos de desarrollo embrionario, en embriones inyectados con una cantidad conocida de mRNA de CK1δ1 y CK1δ2, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podrían estar involucradas estas isoformas. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que la sobre expresión de ambas isoformas, CK1δ1 y CK1δ2, inducen distintos grados de malformación en cerebro anterior y ojos, siendo el fenotipo principal observado con la inyección de CK1δ1 los embriones sin ojos. El bloqueo de función mediante Dominantes Negativos indujo, en ambas isoformas, embriones dorsalizados y ciclópicos. Se puede concluir, que las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 están participando en la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente cerebro anterior y ojos.

The protein CK1 is a family of kinase proteins which has recently been implicated in embryonic development. At least seven isoforms of this family have been cloned: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. In this thesis, expression and function studies of both genes CK1δ1 y CK1δ2 were performed during embryonic zebrafish development (Danio rerio). For this, we analyzed the expression pattern of these genes by in situ hybridization and RT-PCR. Those results indicate that both isoforms have a similar early expression pattern. Both genes express ubiquously since the first hour post fecundation (h.p.f) until 8 h.p.f. From this moment, CK11 restricts its expression to Central Nervous System. CK12 is ubiquously express until 24 h.p.f. After, it restricts its expression to the cephalic region and pectoral fins. In order to analyze the function of both isoforms, overexpression studies were performed by CK1δ1 and CK1δ2 mRNA injection. We also made “blockade of function” assays by injecting mRNA in zebrafish embryos of the dominant negative mRNA of each isoform. These experiments were carried out by microinjection techniques in embryos at the one-cell stage. After injection, the embryos were incubated and observed in different stages using a stereoscopic microscope, and classified according to their phenotype. In addition, we analyzed the expression pattern of some gene markers in embryos injected with knowing amounts of CK1δ1 y CK1δ2, to have a better idea of the processes and pathways in which this isoform could be involved. The results obtained with the experiments described here, indicated that the overexpression studies of both isoforms, CK1δ1 y CK1δ2, induced forehead and eyes abnormalities, being the “no eyes” embryo the main fenotype observed with the CK1δ1 injection. The “blockade of function” experiments, by dominants negative CK1 isoform injection, induced in both isoforms, dorsalized and cyclops embryos. In conclusion, we propose that CK1δ1 and CK1δ2 are involved in the processes that regulate the axis formation of the embryos during early development of the zebrafish, as well as in the formation of structures of the central nervous system, specially forehead and eyes