Optimización de las condiciones de cultivo y mejora en la proliferación de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

Abstract

Las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASC) son células multipotentes de gran interés en medicina regenerativa. Para tener efectos terapéuticos se requieren dosis de cientos de millones de células, sin embargo, esas cantidades no pueden ser aisladas desde tejido graso. Por lo anterior, se han desarrollado distintas estrategias para expandir hASC in vitro: cultivos 2-D y 3-D, condición de hipoxia, y enriquecimiento del medio de cultivo. El objetivo general del presente trabajo es incrementar la cinética de crecimiento de hASC explorando el enriquecimiento del medio de cultivo y las condiciones de normoxia e hipoxia, conservando las propiedades fenotípicas y el potencial de diferenciación de células madre mesenquimales. En particular, el medio de cultivo basal utilizado fue α-MEM antiOX (con antioxidantes) desarrollado en el trabajo de Lorna León, y para el enriquecimiento se utilizó piruvato y nicotinamida. El piruvato actúa como nexo entre la glicólisis y el ciclo tricarboxílico, mientras que la nicotinamida es utilizada como precursor de NAD+. Se montaron cultivos en monocapa con concentraciones de piruvato y nicotinamida entre 1 a 10 mM de acuerdo a un Diseño de Experimentos en hipoxia (5% O₂) y normoxia (~21% O₂). Se caracterizó la cinética de crecimiento y el metabolismo de la población celular de cada cultivo, y se utilizó el fold change del número de células desde el inicio de la fase exponencial hasta el inicio de la fase estacionaria para ser ajustado a un Modelo de Superficie de Respuesta y encontrar una combinación óptima de concentraciones de piruvato y nicotinamida dentro del dominio experimental en normoxia e hipoxia. Se observó que el piruvato y la nicotinamida poseían efectos sobre el crecimiento y metabolismo de hASC tanto en normoxia como en hipoxia. De acuerdo a los Modelos de Superficie de Respuesta, se determinó que las concentraciones óptimas correspondían a 6,29 mM piruvato y 6,37 mM nicotinamida en normoxia, y 3,82 mM de piruvato y 2,8 mM nicotinamida en hipoxia. Al probar el medio α-MEM antiOX enriquecido en piruvato y nicotinamida se obtuvo un mejor desempeño en el crecimiento de hASC y una mayor eficiencia en el aprovechamiento de los nutrientes respecto a la condición basal, reportando un fold change de 6,22 en normoxia y 5,2 en hipoxia, y un rendimiento de lactato a partir de glucosa más piruvato de 1,14 en normoxia y 1,32 en hipoxia. Considerando que la condición normóxica demostró ser más favorable para el crecimiento de hASC, se realizaron pruebas de inmunotipificación de marcadores de superficie y pruebas de diferenciación, mostrando que las hASC cultivadas en medio α-MEM antiOX enriquecido conservan sus propiedades fenotípicas y el potencial de diferenciación. Finalmente, el cultivo fue escalado a suspensión con microcarriers Cytodex® 1 donde no se obtuvieron resultados satisfactorios, por lo que eventualmente se recomienda repetir el experimento.