Producción en biorreactor de una FPMO termoestable y minería genómica de FPMOS putativas provenientes de actinomicetos aislados del lupino del desierto de Atacama

Abstract

Las flavoproteínas monooxigenasas (FPMOs) de clase B catalizan la incorporación de un átomo de oxígeno a un sustrato y la reducción del otro átomo de oxígeno a agua, son enzimas redox que utilizan un cofactor de flavina adenina dinucleótido (FAD) y NADPH o NADH como donante de electrones. Recientemente se ha reportado una FPMO de clase B llamada TmCHMO, originaria del microorganismo Thermocrispum municipale, de gran potencial biotecnológico, cuya expresión es recombinante, soluble y activa, resultando atractivo conocer su alcance para sustratos de gran relevancia farmacológica y establecer un protocolo de producción de esta enzima el cual sirva como referencia para analizar la expresión heteróloga de otras FPMOs putativas, homologas a TmCHMO, obtenidas de la búsqueda bioinformática en el genoma de 6 Micromonosporas y 4 Streptomyces provenientes del Lupino del Desierto de Atacama, recientemente aisladas y secuenciadas. El siguiente trabajo aborda la producción de TmCHMO en Escherichia coli TOP10- pBAD-His-tag-SUMO a escala biorreactor, cuya inducción se realizó con L-arabinosa 0,1% (p/v) en el cultivo y la actividad enzimática máxima alcanzada fue de 36 [UI/gBS] para ciclohexanona. También se purificó TmCHMO en FPLC con afinidad a Níquel y se demostró que TmCHMO purificada es capaz de catalizar la transformación de los fármacos de Clomifeno, Dasatinib y en menor actividad Tamoxifeno. Los productos de la reacción de oxidación se utilizan en el estudio de la farmacocinética del medicamento permitiendo determinar su efectividad en los diferentes tratamientos. Por otro lado, se buscó y seleccionó bioinformáticamente 4 FPMOs putativas en base al % de identidad de 35% mínimo, E-value cercano a 0 y secuencias conservadas para FPMOs de clase B y sus respectivas subclases. Se analizó la expresión heteróloga en Escherichia coli TOP10-pBAD-His-Tag-SUMO y se observó que para MO2 y MO3 no hubo expresión heteróloga en ninguna de las fracciones analizadas, mientras que para MO1 y MO4 se observó expresión insoluble, sin embargo, no se pudo mejorar la expresión en la fracción soluble pese a las modificaciones en las condiciones de cultivo. Se concluye que establecer una metodología para producir de manera soluble y activa una FPMOs de clase B como TmCHMO no asegura la expresión soluble de otras FPMOs putativas de clase B homologas a TmCHMO. Surgiendo la posibilidad de modificar o cambiar el sistema de expresión heterólogo utilizado con la finalidad de producir de forma recombinante, soluble y activa FPMOs promisorias para la industria biotecnológica.