Producción de xilanasa en un sistema de expresión constitutivo

Abstract

En la actualidad el mercado de las enzimas está en crecimiento, ya que estas tienen aplicaciones en varias áreas, desde la industria de alimentos hasta detergentes de uso doméstico. Dentro de estas se encuentra la xilanasa, enzima capaz de degradar el xilano y generar xilooligosacáridos (XOS). El xilano es uno de los compuestos principales de la biomasa lignocelulósica (LCB, materia vegetal seca), la cual se encuentra en grandes cantidades como desechos forestales y agrícolas. Adicional- mente los XOS son prebióticos, por lo que tienen un gran aporte nutricional para los organismos que los consumen, siendo un producto que puede comercializarse en la industria alimentaria tanto como farmacéutica. Para generar XOS es necesario producir xilanasas a gran escala y de manera rentable, ya que hasta ahora se producen en sistemas de expresión inducibles por metanol, usando el promotor PAOX1 y Pichia pastoris como hospedero. Esto es difícil de escalar por el metanol, ya que es un compuesto tóxico, flamable y costoso, además de que los procesos inductivos son batch por lo que son complejos de escalar a un proceso continuo. De esta manera se realizó la construcción del vector pGAP9K-Xyl, sistema de expresión cons- titutivo, que usa el promotor GAP gracias a su alto rendimiento en producción de proteínas heteró- logas y a la cantidad de información disponible al respecto. Se transformó el vector en P. pastoris. Se realizó un análisis de la secuencia nucleotídica y aminoacídica del promotor GAP, factor alfa y xilanasa, y se corroboró que el clonamiento fue exitoso. Se realizaron cultivos de las colonias transformantes en medio YPG a 30oC, en los cuales, si bien se observó mayor hidrólisis del xilano que en el cultivo con P. pastoris sin inserto, no se observó la producción de xilanasa. Se discuten las diferentes razones por las cuales la producción enzimática puede fallar, dentro de las cuales se encuentran las condiciones de cultivo (pH, temperatura), bajo número de copias del gen de interés en el genoma de P. pastoris o el estrés metabólico que sufre la levadura al cambiar al sistema constitutivo, entre otras. Finalmente se concluye que no hay producción de xilanasa en el sistema constitutivo en P. pastoris en medio YPG y a 30oC. Se recomienda realizar más experimentos y evaluar más variables antes de determinar que el vector pGAP9K-Xyl no es capaz de producir xilanasas constitutivamente en P. pastoris.