Motility of soil bacteria Bradyrhizobium diazoefficiensin microfluidic devices

Abstract

Las bacterias Bradyrhizobium diazoefficiens (B. diazoefficiens) son capaces de fijar nitrógeno atmosférico al suelo en simbiosis con las plantas de soja, lo que permite utilizarlas como biofertilizante. El rendimiento de este biofertilizante depende, en parte, del número de bacterias que logran viajar desde los sitios de inoculación hasta las raíces, para luego formar nódulos fijadores de nitrógeno. Esto motiva a conocer el proceso de transporte de estos microorganismos a través del suelo y los factores externos que lo afectan, lo que hasta ahora ha sido poco estudiado, debido a la imposibilidad de observar directamente el nado de bacterias a través del suelo. La cepa salvaje (WT) de B. diazoefficiens posee dos sistemas de flagelos con los que se autopropulsa: el subpolar, que consiste en un único flagelo que nace cerca uno de los polos del cuerpo de la bacteria, y el lateral, conformado por varios flagelos más largos y delgados que el subpolar, anclados por el costado del cuerpo de la bacteria. La presencia de dos sistemas flagelares independientes es inusual, y aún no se conoce el rol de los flagelos laterales, los que a diferencia del subpolar, no son constitutivos y solo se expresan de acuerdo a condiciones nutricionales específicas. Para esta tesis se diseñó y fabricó una serie de dispositivos microfluídicos para caracterizar experimentalmente la motilidad de distintas cepas de B. diazoefficiens en condiciones de interés práctico y académico. El primer dispositivo es una cavidad cilíndrica, con la que se estudió en condiciones cuasi-desconfinadas el nado de la cepa WT, y las mutantes ΔlafA (que solo expresa el flagelo subpolar) y ΔfliC (que solo expresa los flagelos laterales), obteniendo sus distribuciones de velocidad de nado y la fracción de bacterias activas en una suspensión. El segundo tipo de dispositivo microfluídico incorpora un medio poroso desordenado que se propone como modelo de suelo artificial. En este dispositivo se estudió el nado de las cepas WT y ΔlafA en un entorno que reproduce cualitativamente a la intrincada estructura de los poros del suelo. Variando el ancho de los canales, se cuantifica el efecto del confinamiento en la velocidad y las estrategias de nado de las bacterias, y en su aglutinación en los canales. Una variante de este tipo de dispositivo se utilizó para medir el coeficiente de difusión traslacional efectivo de la cepa WT. Finalmente, con un tercer tipo de dispositivo, se estudiaron los efectos del cizalle sobre la motilidad de las cepas WT y ΔlafA, sometiendo a las bacterias a flujos externos por tiempos constantes o a lo largo de distancias constantes. Se observaron caídas en la velocidad media de nado y la fracción de bacterias activas, las cuales se recuperan parcialmente con el tiempo. Se determinaron las tasas de corte críticas para la pérdida de motilidad y los tiempos característicos asociados a su recuperación. Los resultados obtenidos en este trabajo, sobre el transporte, la motilidad y los efectos del cizalle en la actividad de estas bacterias de suelo, pueden ser utilizados como referencia para que, desde la biología sintética, se desarrollen nuevas cepas mutantes que mejoren su eficiencia como biofertilizante, constituyendo un aporte sustancial para la agronomía sustentable.

Bradyrhizobium diazoefficiens (B. diazoefficiens) is a soil bacterium able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with soybean. For this reason, it is used as a biofertilizer. One of the main factors that determine the performance of this biofertilizer is the effective number of bacteria that successfully travel from the inoculation sites to the roots, where they can form nitrogen-fixing nodules. This motivates us to study the transport process of these microorganisms through the soil and the external factors that affect it, which until now has been poorly studied due to the impossibility to directly observe their swimming through soil. Interestingly, the wild-type (WT) strain of B. diazoefficiens has two flagellar systems with which it self-propels: the subpolar, consisting of a single flagellum whose base is located near one of the poles of the body of the bacterium, and the lateral, formed by several flagella, longer and thinner than the subpolar, anchored on the side of the body of the bacterium. The presence of two independent flagellar systems is unusual, and the exact role of the lateral flagella, which in contrast to the subpolar flagellum, are not constitutive and are only expressed according to specific nutritional and ambiental conditions, is still unknown. For this thesis, a series of microfluidic devices were designed and fabricated to experimentally characterize the motility of different strains of B. diazoefficiens under conditions of practical and academic interest. The first device is a cylindrical cavity that was used to study, under quasi-unconfined conditions, the swimming of the WT strain, and the mutants ∆lafA (which only expresses the subpolar flagellum) and ∆fliC (that only expresses the lateral flagella), obtaining their swimming speed distributions and the fraction of active bacteria in a suspension. The second type of microfluidic device incorporates a disordered porous medium that is proposed as an artificial soil model. By varying the width of the channels in the porous medium, the effects of different levels of confinement on the speed and swimming strategies of the WT and ∆lafA, as well as their agglutination in the channels, were quantified. Then, a variant of this microfluidic device was used to measure the effective translational diffusion coefficient of the WT strain. Finally, with a third type of device, the effects of shear on the motility of WT and ∆lafA strains were studied by exposing the bacteria to external flows over constant distances or for constant times. Decreases in the mean swimming speed and the fraction of active bacteria were observed, which partially recovered with time. The critical shear rates for the decay of motility and the characteristic recovery times were experimentally measured. The results presented in this work, both for the transport and motility of these soil bacteria, as well as for the effects of the shear on their activity, can be used as a reference for the development, from the field of synthetic biology, of new mutant strains of B. diazoefficiens that improve their efficiency as biofertilizers, constituting a substantial contribution to sustainable agronomy.