MicL un posible regulador de la susceptibilidad a antibióticos en Shigella sonnei

Abstract

Una de las principales causas de muerte en niños en el mundo corresponde a los cuadros diarreicos producto de infecciones bacterianas. Uno de los agentes causales de este cuadro clínico es Shigella spp., enteropatógeno que afecta solo al ser humano y es responsable de producir la shigelosis, enfermedad caracterizada por diarrea sanguinolenta, con mucus y pus. Esta suele ser autolimitada, pero en algunos casos es necesario el tratamiento antimicrobiano puesto que disminuye la excreción de la bacteria y acorta los días de infección. El género está constituido por 4 serogrupos: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei. En Chile los más frecuentemente aislados son S. flexneri y S. sonnei. Se observa un aumento de la resistencia a antibióticos en S. sonnei, por esto se buscan novedosas formas de contrarrestar este fenómeno, una de estas son los RNA pequeños (sRNA), ya que están implicados en la regulación postranscripcional. En S. sonnei se describió que SdsR disminuye la resistencia a quinolonas. En esta misma línea, se buscaron nuevos sRNAs que regulen la resistencia a antibióticos. Un sRNA descrito recientemente es MicL que interactúa con el mensajero que codifica a la lipoproteína Lpp, la cual se ha demostrado que tiene un rol en la susceptibilidad a diversos químicos, dentro de estos a vancomicina, hipotetizando una relación entre el sRNA MicL y la susceptibilidad a antibióticos. En base a los antecedentes se propone que la sobreexpresión de micL en S. sonnei, aumenta la susceptibilidad a antibióticos. En el presente estudio se analizó el efecto de la sobreexpresión del gen micL y su relación con la susceptibilidad a antimicrobianos. Estudios previos muestran que MicL sufre un procesamiento generando un sRNA de menor tamaño, por lo que en esta

tesis se evaluó el efecto tanto de MicL largo como pequeño, para ello se clonó cada gen de micL (micL- L y micL-S) en un vector de expresión, el cual fue transformado en la cepa de S. sonnei. Primero se

corroboró la expresión de los sRNA mediante RT-PCR, luego se observó que la sobreexpresión del gen no altera el crecimiento bacteriano. En los estudios de susceptibilidad no se observaron cambios cuando se analizó la mayoría de los antibióticos, no obstante, el aumento de MicL-S y MicL-L genera una disminución de la susceptibilidad a ciprofloxacino, pero dentro de niveles subinhibitorios, variando de 0,0078 μg/mL en la cepa sin sobreexpresión de micL a 0,0156 μg/mL cuando se sobreexpresa micL. Un resultado interesante fue al realizar una prueba de viabilidad donde se observó un aumento en la susceptibilidad a vancomicina, antibiótico que normalmente no afecta a bacterias Gram negativo. En base a estos resultados se prueba parcialmente la hipótesis propuesta, sin embargo, este estudio sugiere por primera vez que MicL tiene un papel en la susceptibilidad a los antibióticos.

Diarrhea caused by bacterial infections is one of the principal causes of death in children worldwide One of the pathogens involved in this disease is Shigella spp., an enteropathogen that only affects humans and is responsible for causing shigellosis, a disease characterized by bloody diarrhea with mucus and pus. The illness is self-limiting in most cases, however antimicrobial treatment is required to reduce bacterial shedding and shorten the days of infection. The genus consists of 4 serogroups: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii and Shigella sonnei. In Chile, S. flexneri and S. sonnei are the most frequently isolated species. An increase in antibiotic resistance has been observed in S. sonnei, thus new therapies are required to reduce this phenomenon. One strategy might involve small RNA (sRNA), as they play a role in post-transcriptional regulation. In S. sonnei, SdsR has been described to decrease resistance to quinolones. Following this same line, our research was focused on finding new sRNAs that regulate antibiotic resistance. MicL, a recently described sRNA, interacts with the messenger that encodes the lipoprotein Lpp, which has been shown to play a role in susceptibility to various chemicals, including vancomycin, suggesting a relationship between MicL sRNA and antibiotic susceptibility. It is proposed that overexpression of the micL gene in S. sonnei increases susceptibility to antibiotics. This study analyzes the effect of micL gene overexpression and its correlation with antimicrobial susceptibility. Previous studies have demonstrated that MicL undergoes processing, generating a smaller sRNA. This Thesis aims to evaluate the effects of long and small MicL over susceptibility of Shigella sonnei. For this purpose, each micL gene (micL-L and micL-S) was cloned into an expression vector and transformed into the S. sonnei strain. The expression of both small RNAs was initially confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) without affecting bacterial growth. No changes were observed in the tested antibiotics during susceptibility studies. However, the increase in MicL-S and MicL-L resulted in decreased susceptibility to ciprofloxacin, within subinhibitory levels, ranging from 0.0078 μg/mL in the strain without MicL overexpression to 0.0156 μg/mL when MicL was overexpressed. Notably, results from a viability test showed increased susceptibility to vancomycin, an antibiotic that typically does not affect Gram-negative bacteria. The findings partially support the hypothesis. However, this study suggests that MicL is involved in antibiotic susceptibility.