Efecto de la presencia de un dominio de unión a carbohidratos en la actividad y termoestabilidad de la endoxilanasa GtXyl10A

Abstract

El desarrollo industrial ha impactado positivamente en el desarrollo de la humanidad, no obstante, el punto en contra es la gran cantidad de desechos que se generan, razón por la cual en los últimos años conceptos como economía circular y sustentabilidad se han hecho cada vez más comunes. El residuo orgánico más abundante en el planeta es la biomasa lignocelulósica la cual proviene principalmente desde industrias agrícolas, por lo que la reutilización del insumo colabora positivamente con los conceptos antes mencionados. Dentro de la biomasa lignocelulósica se encuentra en gran proporción el xilano, molécula que al degradarse se convierte en xilooligosacáridos, las cuales presentan propiedades prebióticas beneficiosas para la salud humana. Una manera de ejecutar la reacción es mediante enzimas xilanasas, sin embargo, estas enzimas poseen temperaturas de máxima actividad de entre 70 [ºC] y 80 [ºC], lo cual implica un alto costo energético del proceso y, por lo tanto, no se vuelve rentable ni sustentable realizarlo a niveles industriales. La motivación de esta memoria fue generar una enzima xilanasa utilizable a temperaturas más bajas que su óptimo. Para ello se utilizó la enzima fúngica GtXyl10A a la que se le agregó el dominio CBM6 en su extremo amino y se define como objetivo general su producción y evaluación. Para cumplirlo se realizó un modelo tridimensional de su estructura evaluando dos opciones de secuencia aminoacídica para la enzima, luego fueron optimizadas y se construyó un gen con el ADN según la secuencia óptima, evaluando distintas metodologías para lograr la mutación deseada. Las enzimas mutada y silvestre se produjeron en paralelo en un sistema de expresión en bacterias Escherichia coli, luego se purificaron y caracterizaron de acuerdo a la dependencia de la actividad en la temperatura de ensayo sobre xilano soluble, termoestabilidad, progreso de la hidrólisis a 50 [ºC] y actividad sobre sustrato con xilano insoluble. Los resultados mostraron que la xilanasa junto al dominio CBM6 presenta mejorías respecto a la silvestre y se cumplen los objetivos propuestos. Sin embargo, la purificación de las proteínas no fue total, lo cual genera incertidumbre sobre ciertos resultados, pero todos con la misma tendencia. Se concluye que la enzima es más activa en temperaturas menores de la temperatura óptima, que posee mayor actividad enzimática y produce una mayor cantidad de XOS prebióticos. Finalmente, la enzima recombinante propuesta es efectivamente una alternativa a las xilanasas nativas, pudiendo proyectar su uso industrial luego de las optimizaciones y los escalamientos correspondientes. De esta forma, el presente proyecto se vuelve una contribución a los problemas medioambientales actuales.