Estudio teórico de la estructura electrónica y de los mecanismos de tautomería lactama-lactima en bilinas de fitocromo

Abstract

El fitocromo es un fotoreceptor de plantas que también se encuentra en bacterias y hongos. En plantas, el fitocromo regula respuestas fotomorfogénicas de la planta como, por ejemplo, el desarrollo y crecimiento del tallo, regulación en el periodo de dormancia y de germinación de las semillas, floración, fototaxis, mecanismos de evasión de la sombra, etc. Todos ellos activados o desactivados en forma diferencial mediante longitudes de onda específicas en la región UV-Visible del espectro electromagnético. El receptor se fotoconvierte entre una forma fisiológicamente inactiva, Pr, y una forma fisológicamente activa, Pfr. La interconversión entre ambas formas ocurre por mecanismos diferentes que aun se desconocen. Por ello, hay un interés creciente respecto al mecanismo de fotoconversión del fitocromo debido a potenciales aplicaciones en biotecnología. Sin embargo, un obstáculo en la investigación del fitocromo ha sido la escasez de estructuras cristalográficas resueltas en el sistema. Con el propósito de predecir las estructuras del cromóforo en fitocromo, hemos utilizado la teoría del funcional de la densidad dependiente del tiempo (TDDFT). Un análisis estructural con cálculos teóricos basados en la TDDFT nos permitieron predecir correctamente una estructura semicíclica ZZZssa para la ficocianobilina en el fitocromo Cph1 de cianobacteria. Con dicho análisis pudimos evaluar el efecto del estado de protonación del cromóforo y el entorno proteico sobre las energías de excitación que entrega la TDDFT, logrando una aproximación cuantitativa cuando se utiliza la geometría de un molde cristalográfico sin optimizar junto con el modelo de polarizable continuo (PCM) para simular las interacciones electrostáticas entre el cromóforo y la apoproteína. Utilizamos un modelo teórico similar para predecir una estructura semicíclia ZZZssa para la fitocromobilina en el fitocromo A de planta donde, además de la aproximación cuantitativa del modelo, también pudimos reproducir el índice espectroscópico Q/S, correspondiente a la razón entre las fuerzas de oscilador de las bandas Q y Soret, respectivamente. Con el propósito de explicar el comportamiento general del índice Q/S para bilinas, se propuso un modelo teórico, donde definimos un término empírico F para el sistema, el cual presenta un componente FS asociado a las funciones intrínsecas del sistema  conjugado (corriente de anillo y aromaticidad) y un componente FQ asociado a la fotoisomerización del cromóforo. Nuestro modelo teórico plantea que, cuando se cambia la conformación del sistema, el término F se conserva (F = FS + FQ), por lo que solamente cambia la distribución entre sus componentes. Con respecto al fotociclo del fitocromo, estudiamos la fase térmica de la fotoconversión de Pr a Pfr. Los espectros teóricos de absorción para la forma Pfr, el análisis de los estados de transición involucrados, y los desplazamientos químicos de RMN nos sugieren que durante la interconversión Pr/Pfr ocurre una tautomería lactamalactima en el anillo A del cromóforo (no así en el anillo D). Además, nuestros resultados indican que es posible que la tautomería se lleve a cabo a través de un mecanismo catalizado por cierta molécula de agua cristalográfica localizada en las proximidades del anillo A de la bilina, , denominada “agua pirrólica”, la que haría de catalizador bifuncional.

Phytochrome is a photoreceptor of plants that is also found in bacteria and fungi. In plants, phytochrome regulates photomorphogenic responses of the plant, e.g., the development and growth of the stem, regulation in the dormancy period and seed germination, flowering, phototaxis, shade avoiding mechanisms, etc. All of them are activated or deactivated in a differential way by means of specific wavelengths on the UV-Visible region of the electromagnetic spectra. The receptor is photoconverted between a physiological inactive form, Pr, and a physiological active form, Pfr. The interconversion between both forms occurs through different mechanisms that are still unknown. Thus, there is a growing interest concerning the mechanism of photoconversion of phytochrome since the potential applications in biotechnology. However, an obstacle in the research on phytochrome has been the scarce of crystallographic structures resolved in the system. With the purpose to predict the structures of the chromophore in phytochrome, we have used the time-dependent density functional theory (TDDFT). A structural analysis with theoretical calculations based on the TDDFT has allowed to predict correctly a semicyclic structure ZZZssa for the phycocyanobilin in phytochrome Cph1 of cyanobacteria. With such analysis we could assess the effect of the protonation state and the protein environment over the excitation energies delivered by the TDDFT, getting a quantitative approximation when the geometry of a crystallographic template is used without optimization, together with the polarizable continuum model (PCM) to mimic the electrostatic interactions between the chromophore and the apoprotein. We have used a similar theoretical model to predict a semicyclic structure ZZZssa for the phytochromobilin in phytochrome A of plants where, besides the quantitative approximation of the model, we could also predict the spectroscopic index Q/S, corresponding to the ratio between the oscillator strengths of the Q and Soret bands, respectively. With the purpose to explain the general behavior of the index Q/S for bilins, a theoretical model was proposed, where we defined an empirical term F for the system, which has a component FS associated to the intrinsic functions of the conjugated system (ring current and aromaticity)  and a component FQ associated to the chromophore photoisomerization. Our theoretical model suggests that, when changing the conformation of the system, the term F is preserved (F = FS + FQ), so that only changes the distribution between its components. With respect to the photocycle of phytochrome, we studied the thermal phase of Pr to Pfr photoconversion. The theoretical absorption spectra for the Pfr form, the analysis of the involved transition states, and the NMR chemical shifts suggest that during the Pr/Pfr interconversion, a lactam-lactim tautomerism occurs in ring A of the chromophore (not in ring D). In addition, our results indicate that is possible that the tautomerism is carried out through a mechanism catalysed by a certain crystallographic water molecule located in the vicinity of ring A of the bilin, called "pyrrole water," which would be a bifunctional catalyst.