Obtención y caracterización de una nueva lipasa bacteriana de origen marino antártico, con actividad enzimática a bajas temperaturas, en su forma nativa y recombinante

Abstract

Las lipasas son enzimas con un gran potencial biotecnológico y altos niveles de demanda pues son utilizadas en múltiples aplicaciones a nivel industrial. Las lipasas que se encuentran disponibles en el mercado son, en su mayoría, de origen microbiano mesófilo y presentan actividad enzimática a 50°C. Por esta razón, muchas veces ven reducida su eficiencia al enfrentarse a condiciones industriales, requiriendo el uso de energía calórica adicional, que se traduce en un incremento en los costos de los procesos. En base a lo anterior, el propósito de esta tesis es la obtención de una nueva lipasa con actividad enzimática a bajas temperaturas. Sabiendo que una buena fuente de este tipo de enzimas son los organismos psicrófilos, dado que su metabolismo se encuentra adaptado parta sobrevivir y crecer en condiciones extremas de frío, se trabajó con 5 distintas cepas bacterianas de origen marino antártico productoras de lipasas. A partir de ellas se logró completar 4 secuencias de genes codificantes de lipasas. Estas presentaban alta identidad entre sí, a pesar de provenir de especies diferentes, y con la proteína lipasa codificada en el genoma de la bacteria Shewanella frigidimarina, siendo distantes filogenéticamente a todas las demás lipasas descritas. Se seleccionó el gen de la cepa identificada como E5 y se clonó en dos vectores de expresión (pET22(b+) y pMAL-c2E), utilizando como huésped heterólogo la bacteria E. coli BL21(DE3). La expresión recombinante de la proteína lipasa se vio dificultada debido a que ésta resultó ser tóxica. Sin embargo, luego de optimizar las condiciones de inducción y utilizando el sistema de pET22(b+), se consiguió la expresión de una lipasa recombinante funcional y activa a bajas temperaturas (15°-25°C). en el periplasma del huésped mesófilo. También se estudió la lipasa nativa producida por la cepa psicrófila E5 y se determinó que esta enzima es extracelular, su expresión es inducida por aceite de oliva, es posible purificarla mediante cromatografía de filtración en gel, presenta actividad enzimática entre 5°-25° C entre los pH 7 y 9. Para ambas lipasas obtenidas de la cepa E5, nativa y recombinante, se realizaron distintos ensayos enzimáticos con los que se estableció que la primera presenta actividad lipolítica frente a los sustratos tributirina y p-nitrofenilcaprato, mientras que la enzima nativa presenta una mayor actividad frente a los mismos sustratos más α-naftilacetato. Finalmente mediante un análisis bioinformático se construyó un modelo tridimensional de la proteína lipasa de la cepa E5 la que resultó ser altamente homóloga en estructura y función con la proteína esterasa brefeldina A de la bacteria Bacillus subtilis.