Participación de la vía WNT/β-catenina en la regulación de la expresión de la isoforma C de la enzima convertidora de endotelina-1 (ECE-1c) y su rol en el fenotipo tumoral invasivo en cáncer de colon

Abstract

En el cáncer colorrectal es fundamental la participación de la vía de señalización Wnt-canónica donde se encuentra aberrantemente activada en más del 80% de los casos. Esta vía es transversal en los seres vivos y participa en el desarrollo, morfogénesis, proliferación y regeneración celular. También está relacionada con numerosas patologías, incluyendo la poliposis adenomatosa familiar (FAP), en la cual pacientes portadores de una mutación heredada en APC (Adenomatous poliposis coli), desarrollan cientos de pólipos en el colon e inevitablemente terminan desarrollando un cáncer. β-Catenina es la proteína central en la vía de señalización Wnt-canónica, ésta es finamente regulada mediante el complejo de degradación conformado por las proteínas de andamiaje axina y APC y las kinasas CK1 y GSK3β las que en conjunto actúan marcando a β-catenina para enviarla a degradación proteosomal. Sin embargo, en forma aberrante alguna de las proteínas del complejo pueden alterarse, activarse o expresarse otras proteínas que promueven la estabilidad de β-catenina, como la proteína kinasa CK2 o AKT/PKB, que en consecuencia disminuyen o evitan la degradación proteosomal de β-catenina, promoviendo que ésta se acumule en el citosol, transloque al núcleo y transactive la expresión de genes junto con los factores de transcripción TCF/LEF. Uno de los genes blanco de la ruta Wnt-canónica es el péptido vasoactivo endotelina-1 (ET-1). Este ha sido estudiado por sus efectos protumorales emergiendo recientemente como un componente importante en el origen, desarrollo y progresión del cáncer debido a su rol en la regulación de procesos como sobrevida, angiogénesis, transición epitelio mesenquimática (TEM), invasión y metástasis. La activación de ET-1 es llevada a cabo por la Enzima Convertidora de Endotelina-1 (ECE-1), la que está sobreexpresada en muchos cánceres, incluyendo el de colon, y presenta 4 isoformas, siendo la mayormente expresada en cáncer la isoforma C. En particular, esta isoforma se ha reportado que tiene un rol proinvasivo en algunos cánceres, como ovárico, prostático y mamario. No obstante, existe escasa información acerca de la regulación de su expresión en estos tejidos. En esta tesis se ha propuesto como hipótesis que “la vía Wnt-canónica regula positivamente la expresión de ECE-1(c) promoviendo la invasividad de células de cáncer colorectal”. Para responder esta hipótesis se analizó mediante western blot, los niveles de expresión de ECE-1 en células de cáncer colorectal, observándose un aumento relacionado con el grado de malignidad de cada línea celular. También se activó la vía Wnt-canónica con inhibidores farmacológicos, encontrándose que los niveles de la enzima aumentaron, mientras que éstos disminuyeron cuando la ruta fue regulada negativamente. Asimismo, se expresó ectópicamente en células embrionarias no tumorales HEK-293T proteínas que participan activando la ruta Wnt-canónica, producto de lo cual los niveles de expresión de ECE-1(c) también aumentaron. Por otro lado, se determinó la capacidad invasiva de distintas líneas celulares de CCR y se observó una relación directa con los niveles de expresión de ECE-1. Para conocer el rol específico de ECE-1c en la invasividad, ésta se expresó ectópicamente en células CHO-K1, observándose un notable aumento en el potencial invasivo de las células que la sobreexpresaron. Finalmente, para darle una proyección clínica a nuestros resultados, se determinó los niveles de mRNA de ECE-1 y ECE-1c en biopsias de cáncer colorrectal de pacientes chilenos, encontrándose niveles significativamente más altos en la porción tumoral de éstas respecto de la no tumoral. En consecuencia, los resultados obtenidos sugieren fuertemente que ECE-1c es un nuevo blanco de la vía Wnt-canónica y que además se comporta como un marcador de progresión y de mal pronóstico en el CCR.

Canonical Wnt signaling pathway is essential in colorectal cancer (CRC) where is activated over 80% of cases. This pathway participates in development, morphogenesis, proliferation and cell regeneration. It is also been implicated in many diseases, including familial adenomatous polyposis (FAP), where patients with an inherited mutation in APC (Adenomatous Polyposis Coli) protein develop hundred of polyps in the colon which consequently develop cancer. β-Catenin is the key protein in the canonical Wnt signaling pathway. It is regulated by a negative multiprotein complex formed by Axin, APC and the kinases CK1 and GSK3β which targets β-catenin to proteasomal degradation. However, abnormally expressed or aberrantly activated proteins that promote β-catenin stability, including protein kinase CK2 or AKT/PKB, can reduce or even avoid proteasomal degradation of β-catenin, promoting its cytosolic accumulation, nuclear migration and transactivation of target genes together with TCF/LEF transcription factors. One of such target genes encodes for endothelin-1 (ET-1) peptide. This has recently emerged as an important component in the cancer progression because its role in regulating cellular processes such as survival, angiogenesis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), invasion and metastasis. Activation of ET-1 is performed by the Endothelin-Converting Enzyme-1 (ECE-1), which is overexpressed in many cancers, including colon. This is expressed as four isoforms (a,b,c and d), being the “c” mostly expressed in cancers, including ovary, prostate and breast, where promotes invasiveness. However, the regulatory mechanism of ECE-1c expression in the above-mentioned cells as well as in colon cancer is unknown. This thesis project proposed the following hypothesis: "The canonical Wnt signaling pathway positively regulates the ECE-1 (c) expression, thereby promoting colon cancer cell invasiveness". In order to answer this hypothesis, up-regulation of β-catenin activity was performed by ectopically expressing GFP-β-catenin, GFP-CK2αCA (a constitutively active mutant), or incubating with a GSK3β inhibitor (LiCl) in human non-tumor, normal (HEK-293T) or colon cancer (HT29-ATCC, DLD-1, HT29-US) cells of increasing malignity. Alternatively, down-regulation of β-catenin activity in the same cells was achieved by expressing HA-AKT-DN (a dominant negative mutant), silencing with a siRNA specific for CK2, or using a specific CK2 inhibitor (TBB). Levels of mRNA and protein of ECE-1(c), survivin (as an endogen control for β-catenin activity) and actin were analyzed by RT-PCR and western-blot, respectively. To evaluate cell invasion capability, a matrigel-based invasion chamber was used in CHO-K1 cells transiently expressing ECE-1c. Finally, in order to demonstrate the clinical relevance of the project, we used human samples to evaluate the alterations in mRNA levels of ECE-1(c) in biopsies from Chilean colon cancer patients. Our results showed that protein levels of ECE-1 positively correlated with the malignant potential of colon cancer cell lines. Using HEK-293T cells, regulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway significantly altered the mRNA and protein levels of ECE-1(c). Additionally, ectopic expression of ECE-1c in CHO-K1 cells led to an increased cell invasion. Finally, mRNA levels of ECE-1 and ECE-1c in biopsies of Chilean colon cancer patients showed significantly higher levels in the tumor portion than the non-tumor control. Therefore, the results obtained in this thesis strongly suggest that ECE-1c is a novel canonical Wnt signaling pathway-dependent target as well as a tumor progression and poor-prognosis marker in colon cancer.