Aislamiento y caracterización inicial de proteínas nucleares que reconocen elementos discretos en el promotor del gen Cs-mnp2B de Ceriporiopsis subvermispora

Abstract

El basidiomicete de pudrición blanca Ceriporiopsis subvermispora es un hongo capaz de degradar la lignina de la madera mediante una serie de enzimas secretadas al medio extracelular. Este sistema ligninolítico está compuesto por las enzimas lacasa (Lcs) y manganeso peroxidasa (MnP) cuyos genes codificantes y sus secuencias regulatorias han sido clonados y secuenciados por nuestro grupo. Tomando en cuenta que la regulación de la expresión de un gen depende de diferentes elementos contenidos en su región promotora, esta actúa como módulo central de procesamiento de diversas señales. Con el objetivo de conocer más sobre el sistema regulatorio de estas enzimas, específicamente de la isoenzima MnP2B, nos propusimos estudiar los posibles factores transcripcionales que se unen al promotor del gen Cs-mnp2B; Para esto se dividió la región promotora en cuatro fragmentos, α1, α2, β1 y β2, los cuales fueron utilizados para ensayos de retardo (EMSA) con extractos de proteínas nucleares preparados a partir de micelio del hongo, para demostrar la formación de complejo proteína-DNA. Posteriormente se realizaron ensayos de competencia que comprobaron la especificidad de la unión a estas sondas. Al analizar mediante footprinting los distintos fragmentos, la sonda β1 mostró los resultados más claros, encontrándose una región protegida de 48 pb. Para analizar este sitio de unión, se diseñó un nuevo partidor que permitió la amplificación de un fragmento de 74 pb, que forma parte de β1 y que contenía dicha secuencia. Esta sonda se denominó β1A y fue analizada con más detalle. Este pequeño fragmento del promotor fue utilizado como sonda en ensayos de EMSA, los que mostraron la unión específica de a lo menos una proteína. Para caracterizar las proteínas unidas a la sonda β1A, el complejo proteína-DNA fue purificado desde el gel de retardo y posteriormente fue resuelto en un gel SDS-PAGE. El resultado de este ensayo mostró la existencia de una proteína mayoritaria en este complejo con una masa molecular entre 60 y 70 kDa. Finalmente se estudió la secuencia que mostró protección en el ensayo de huella digital o “footprinting”, con los programas computacionales CBRC y TESS, los que predicen cajas de unión putativas a factores transcripcionales. El análisis conjunto de ambos programas mostró la probable unión de seis proteínas, ADR1, GCN4, Hsf1, SRY, Stuap y Ttk69, de las cuales al menos tres podrían estar directamente relacionadas con la regulación del gen Cs-mnp2B

The white-rot basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora is able to degrade lignin from wood trough an array of extracellular secreted enzymes, its ligninolytic system composed by laccase (Lcs) and manganese peroxidase enzymes. Their coding sequences and regulatory regions have been cloned and sequenced by our group. Taking into account that the regulation of the expression of a particular gene depends on different elements contained in its promoter region, we decided to explore the possible transcription factors that may interact with the promoter region of the Cs-mnp2B gene. Since promoter regions act as key elements that process a broad type of signals, the aim of this work was to study to some extent the regulatory mechanisms of the genes encoding for these enzymes. For this purpose, the Cs-mnp2B promoter region was divided into four different fragments named α1, α2, β1 and β2. To demonstrate a protein-DNA interaction, all these fragments were incubated with protein nuclear extracts prepared from fungal mycelia and used as DNA probes for electromobility-shift assays (EMSA). Using all the aforementioned probes, the protein-DNA interaction specificity was studied by competition analysis. By means of footprinting, a 48bp protected region was only clearly identified when using the β1 probe. To analyze this binding region, a new primer was designed to allow the amplification of a 74bp fragment that it is part of the b1 probe and that also contains the mentioned sequence. This new probe was named b1A and it was further analyzed. When used as a probe, EMSA showed a specific interaction with at least one nuclear protein. The observed protein-DNA complex was gel-purified and subsequently loaded onto a SDS-PAGE to characterize the proteins present in the complex. The existence of a major protein with a molecular mass between 60 and 70 KDa was observed within the protein- DNA complex. Finally, the footprinting-protected sequence was further analyzed using the CBRC and TESS computational software, which predicts transcriptional factors putative binding regions. According to both analyses, six proteins named ADR1, GCN4, Hsf1, SRY, Stuap and Ttk69 showed to be the most probable binding candidates. Among these proteins, only three may be directly involved in the regulation of the Cs-mnp2B gene