Participación del dominio S97N de la proteína DLG en el desarrollo de la sinapsis neuromuscular de larvas de Drosophila melanogaster

Abstract

La localización precisa de los componentes sinápticos durante el desarrollo requiere del ordenamiento de una red de proteínas entre las cuales participan proteínas andamio de la familia MAGUK (membrane-associated guanylate kinases). Los miembros de esta familia reclutan receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas del citoesqueleto en complejos macromoleculares a través de sus dominios de interacción proteína-proteína. La sinapsis neuromuscular de la larva de Drosophila melanogaster es un excelente modelo de sinapsis centrales de mamíferos. En esta sinapsis glutamatérgica, la proteína andamio Discs large (Dlg), un miembro de la familia MAGUK, cumple un papel importante en la formación de la sinapsis y en la localización de proteínas involucradas en la transducción de señales. Se ha demostrado que Dlg determina la localización sináptica del canal de K+ tipo Shaker, Fasciclina II (FasII), una molécula de adhesión celular involucrada en el crecimiento y plasticidad de la sinapsis neuromuscular y Scribble (Scrib), una proteína involucrada en el mantenimiento de la concentración de vesículas sinápticas en los sitios de liberación durante la estimulación de alta frecuencia. Dlg, además participa en otros procesos, incluyendo el mantenimiento de la polaridad apicobasal de los epitelios, el control de la proliferación y la neurogénesis embrionaria. Todas estas funciones han sido atribuidas a una sola isoforma, DlgA. Sin embargo, en nuestro laboratorio se aislaron una serie de transcritos que corresponden a variantes de procesamiento alternativo del gen dlg que presentan en su extremo 5’ una región que codifica un segmento de 65 aminoácidos llamado S97N y que está ausente en DlgA. Las variantes de dlg que contienen S97N como la proteína denominada DlgS97, sólo se expresan en sistema nervioso y músculo, a diferencia de DlgA que también se expresa en células epiteliales. En este trabajo se estudió el papel de las variantes del gen dlg con dominio S97N en la estructura y formación de la sinapsis de la unión neuromuscular de la larva. Mediante análisis de “western blot” se determinó la proteína DlgS97 de ∼116 kDa y al menos una variante de DlgA de ∼97 kDa. Experimentos de ganancia y pérdida de función específicas para las variantes epitelial y neuronal muestran que las variantes que contienen el dominio S97N participan en el desarrollo de la sinapsis, afectando la morfología y el número de botones sinápticos, además de la expresión de la proteína Scrib y parcialmente la localización de FasII en la sinapsis. Esto difiere de lo observado para la pérdida de función de DlgA que no parece afectar la morfología o expresión de Scrib, aunque sí afecta el número de botones y la expresión de FasII. Mediante ensayos en matriz sólida e inmunoprecipitación se logró determinar que el dominio S97N es capaz de formar homodímeros, sin interactuar con dominios de DlgA. Estos resultados sugieren que ambas isoformas participan en la sinapsis pero con funciones diferentes, formando complejos macromoleculares de manera independiente

The precise location of the synaptic components during development requires the arrangement of a protein network which includes scaffold proteins of the MAGUK family. The members of this family of proteins recruit receptors, ionic channels, signal transduction components and proteins of the cytoskeleton to macromolecular complexes through protein-protein interaction domains. The neuromuscular synapse of the Drosophila melanogaster larva has been used as a model of mammalian central synapses. In this glutamatergic synapse, the scaffold protein Discs large (Dlg), a member of the MAGUK (membrane-associated guanylate kinases) family of proteins, has an important role in the formation of the synapse and in the localization of proteins involved in signal transduction. It has been demonstrated that Dlg determines the synaptic localization of the Shaker K+ channel, of Fasciclin II (FasII), an adhesion molecule involved in the growth and plasticity of the neuromuscular synapse and of Scribble (Scrib), a protein involved in the maintenance of the synaptic vesicle pool in the release sites during high frequency stimulation. Dlg also participates in other processes, including the maintenance of the epithelial apico-basal polarity, the control of proliferation and embrionic neurogenesis. All these functions have been attributed to a single isoform, DlgA. In our laboratory, however, a number of transcripts has been isolated that represent alternatively processed products of the gene dlg, these present a 5' region that encodes a segment of 65 amino acids called S97N that is absent in DlgA. The variants S97N-containig as protein denominated DlgS97 are only expressed in nervous system and muscle, unlike DlgA that is also expressed in epithelial cells. In this work, the role of Dlg variants with S97N domain in the structure and development of the neuromuscular junction was studied. Western blot analysis indicates the presence of the protein DlgS97 of 116 kDa and at least one variant of DlgA of 97 kDa. Loss of function and gain of function experiments specific for the epithelial and neuronal variants show that variants containing the S97N domain participate in the development of the synapse, affecting the morphology and number of synaptic boutons, together with the expression of Scrib and the partial localization of FasII at the synapse. This is different from the DlgA loss of function where the morphology or the expression of Scrib does not change, although the number of boutons and the expression of FasII is affected. By pulldown and inmunoprecipitation assays it was possible to determine that the S97N domain is able to undergo homodimerization, but does not interact with domains of DlgA. These results suggest that both isoforms participate in the synapse but with different functions, forming macromolecular complexes in an independent way