Comparación de la cinética de la infección de ovas de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con dos cepas de Piscirickettsia salmonis detectada mediante dot-blot#

Abstract

En un estudio previo, se comprobó mediante microscopía de barrido, que la cepa LF-89 se adhiere a la pared de la ovamediante prolongaciones de su membrana externa, estructuras que han sido denominadas "Complejo de AdhesiónPiscirickettsial" o CAP, lo que facilitaría la posterior penetración de la bacteria al interior de la ova. Sin embargo,existen otras cepas aisladas, como la SLGO-95, que es más virulenta y resistente a antibióticos que la LF-89 y que no seha estudiado la posibilidad de unión a ovas. Por lo anterior, en el presente trabajo se comparó la cinética de infección deovas de trucha arcoíris, entre ambas cepas, utilizando como metodología la técnica de dot-blot. El método de "dot-blot"se realizó mediante la retención de proteínas en una membrana de polivinildifluoruro (PVDF), incubación conanticuerpos oligoclonales anti-P. salmonis y posteriormente con un segundo anticuerpo anti inmunoglobulina G deratón conjugado con peroxidasa. La reacción antígeno-anticuerpo se evidenció mediante un sustratoquimioluminiscente, utilizando una película autorradiográfica. La evaluación de la reacción se realizó mediantedensitometría utilizando un "software" computacional. Para estandarizar el método se realizaron diluciones seriadas dela suspensión de P. salmonis, desde 0,02 a 56 μg de proteína total. Para aumentar la sensibilidad se centrifugaron lasmuestras a 11.000 x g por 60 min. Además, se probaron diferentes concentraciones de anticuerpo primario, 1:1000,1:5000 y 1:10.000 y muestras de ovas y bacteria fueron sometidas a desnaturalización por ebullición. Se utilizaron ovasde reproductores libres de infecciones virales, Renibacterium salmoninarum y P. salmonis. Las ovas fueron incubadas(en duplicado) con 500 μL de una suspensión de P. salmonis, ya sea con la cepa LF-89 o SLGO-95 por 1,3, 10 y 60min. Luego, cada ova fue congelada a -70°C hasta ser procesada para la técnica de "dot blot". La muestra nocentrifugada de P. salmonis fue detectada como positiva sólo hasta 0,4 μg de proteína total. Cuando fue centrifugada a11.000 g por 1 h, la bacteria fue detectada hasta la última dilución estudiada (0,02 μg). Por otra parte, no hubo grandesdiferencias en la positividad obtenida mediante las tres diluciones de anticuerpos primarios. De acuerdo, al"background" obtenido y nitidez, se consideró como una mejor dilución de trabajo 1:5000. Cuando se realizó la cinéticade infección con la cepa LF-89, los resultados indicaron la aparición de señal positiva desde 1 min de exposición de lasovas a la bacteria. La reacción positiva se mantuvo hasta los 60 min. Con respecto a la cepa SLGO-95, los resultadosfueron similares, sin embargo, la cepa SLGO-95 demostró un mayor número de píxeles, lo que indica que esta cepa seune a la ova en mayor cantidad. Los resultados apoyan los estudios anteriores que indican que P. salmonis es capaz deinfectar verticalmente las ovas y que esta podría ser una de las formas de transmisión del agente en condiciones decultivo. Además, se comprueba que el grado de infección depende del tipo de cepa actuante.