Estudio de propiedades anti-inflamatorias de extractos foliares de dos genotipos de murtilla (Ugni molinae Turcz.)

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares se caracterizan por una desregulación del proceso inflamatorio, el que se perpetúa por activación del factor transcripcional NF-κB y sobreproducción de mediadores proinflamatorios como TNF-α, IL-1β, y prostaglandinas, entre otros. Los fibroblastos cardiacos (FC) son un tipo celular crucial en la mantención estructural y funcional del tejido cardiaco ya que actúan como “células centinelas”, censando el ambiente proinflamatorio, y produciendo matriz extracelular (MEC) para reparar el daño tisular después de una injuria al corazón. El rol de los FC se ha estudiado en sepsis y es relevante en patologías asociadas a fibrosis e inflamación. Ugni molinae Turcz., Myrtaceae, es un arbusto nativo del centro y sur de Chile y de zonas aledañas de Argentina. Sus hojas se han utilizado en la medicina tradicional como antiinflamatorio y analgésica de las vías urinarias. Sus extractos foliares, como los de acetato de etilo y etanólico, tienen efectos farmacológicos comprobados tales como actividad analgésica y antiinflamatoria in vivo, y por otro lado capacidad antioxidante y actividad antibacteriana sobre microorganismos de interés clínico, entre otros. Estas propiedades son atribuidas a la presencia de triterpenos pentacíclicos y compuestos fenólicos. La gran variedad genotípica que caracteriza a esta especie es responsable de los diferentes perfiles químicos de los extractos foliares de murtilla. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de extractos de hoja de dos genotipos distintos de murtilla, EET22-1 (extracto etanólico del genotipo 22-1) y EAE23-2 (extracto de acetato de etilo del genotipo 23-2), sobre la viabilidad celular, y mediadores pro inflamatorios regulados por NFκB en FC. Los EET22-1 y EAE23-2 se prepararon a partir de hojas secas y molidas por extracciones sucesivas con solventes de polaridad creciente como hexano, diclorometano acetato de etilo y etanol de dos genotipos elegidos por su mayor capacidad antiinflamatoria in vivo y su capacidad antioxidante. El cultivo primario fue de FC de rata neonata, mantenido en medio DMEM/F-12 con FBS 2%. Las células se estimularon con LPS 1μg/mL por 24 horas en ausencia y presencia de extracto (0,1-1-10 y 100 μg/mL). Se determinaron a) viabilidad celular por MTT, b) niveles proteicos de p65, IL-1β, COX-2 y VCAM-1 por Western blot, c) actividad de MMP-9 por zimografía y d) concentración de nitrito por reacción de Griess. Ambos extractos mantuvieron viabilidad celular hasta los 10 μg/mL, sin embargo esta disminuyó significativamente con 100 μg/mL de EAE23-2, y 500 μg/mL de EET22-1, en relación al control sin extracto; esta diferencia se atribuye a las diferencias de composición química entre ambos extractos. No se observó una disminución significativa para los grupos pre y post tratado, respecto al control LPS, en ninguno de los parámetros evaluados por Western blot a excepción del grupo pre tratado con la mayor concentración de EET22-1 para VCAM-1. Se observó un aumento en la actividad de MMP-9 en la mayoría de las condiciones. No se pudieron validar los resultados obtenidos para la cuantificación de nitrito a las 24 horas. Los dos extractos mantuvieron la viabilidad celular a concentraciones bajas y medias, siendo EET22-1 menos citotóxico a altas concentraciones. Ninguno de los extractos pudo disminuir significativamente los mediadores evaluados en este modelo celular, a las 24 horas, aunque los extractos solos no demostraron aumentar los estímulos inflamatorios a concentraciones bajas y medias. Se observó una tendencia al aumento en la actividad de MMP-9 en la mayoría de las condiciones estudiadas, lo que podría apuntar a una posible actividad antifibrótica de los extractos; son necesarias más pruebas para apoyar esta idea

Cardiovascular deseases are characterized by a desregulated inflammatory process, wich is kept on by the activation of transcriptional factor NF-κB and overproduction of pro-inflammatory mediators like TNF-α, IL-1β, IL-6 and prostaglandins, among others. Cardiac fibroblasts (CF) are a crucial cellular type in the structural and functional maintenance of the cardiac tissue, by acting like “sentinel cells”, censoring the pro-inflammatory environment and producing extracellular matrix (ECM) for the repair of tissue damage after cardiac injury. The CF role has been studied in sepsis, and its relevant in pathologies associated with fibrosis and inflammation. Ugni molinae Turcz., Myrtaceae, is a native bush from the centric and southern areas of Chile and adjacent areas from Argentina. Its leaves have been used in traditional medicine as anti-inflammatory and analgesic of the urinary tract. Leaves extracts, like the ethanolyc extract and the ethyl acetate extract, have proven pharmacological effects, like in vivo analgesic and anti-inflammatory activity, antioxidant capacity and antibacterial activity on microorganism of clinical interest, among others. These properties are attributed to the presence of pentacyclic triterpenoids and phenolic compounds. The great genotypic variety which characterizes this species is responsible for the different chemical profiles of the leaves extracts of murtilla. This studies aim was to evaluate the effects of the leaves extract of two different genotypes of murtilla, EET22-1 (ethanolic extract of genotype 22-1) and EAE23-2 (ethyl acetate extract of genotype 23-2), on the cellular viability and pro-inflammatory mediators regulated by NFκB in CF. EET22-1 and EAE23-2 were prepared from the dry and minced leaves by successive extractions with growing polarity solvents like hexane, dichloromethane, ethyl acetate and ethanol from the genotypes selected for their in vivo anti-inflammatory capacity and antioxidant capacity. The primary culture from CF of neonatal rat was maintained with DMEM/F-12 medium with FBS 2%. The cells were stimulated with LPS 1μg/mL for 24 hours in absence or presence of the extracts (0,1-1-10 y 100 μg/mL). Determinations were made for a) cellular viability by MTT assay, b) protein levels of p65, IL-1β, COX-2 and VCAM-1 by Western blot, c) MMP-9 activity by zymography and d) nitrite concentration by Griess reaction. Both extracts maintained cellular viability till 10 μg/mL, nevertheless it decreased significantly at 100 μg/mL EAE23-2, and 500 μg/mL EET22-1, related to the untreated control; this difference was attributed to the differences in chemical composition between the extracts. It was not observed a significant decrease for the pre and post treated groups, compared with the LPS control, in any of the Western blot evaluated parameters, except for VCAM-1’s pretreated group with the larger concentration of EET22-1. MMP-9 showed an increased activity in most conditions, while the nitrite assays couldn’t be validated at 24 hours. The extracts maintained cellular viability at low and medium concentration, with EET22-1 being less cytotoxic at higher concentrations. The extracts couldn’t decrease significantly the evaluated mediators, at 24 hours, but the extracts without LPS did not increase the inflammatory stimulus at low and medium concentrations. It was observed an upward trend in the MMP-9 activity in most of the studied conditions, which could point to a possible anti fibrotic activity of the extracts; more test are needed to support this idea