Papel de HIF-1[alfa] en la transición desde la activación de PI3K hacia el arresto del ciclo celular promovidos por Helicobacter pylori en células gástricas humanas

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno gástrico humano asociado al desarrollo de cáncer gástrico. En células epiteliales gástricas, la infección con H. pylori promueve la activación de diversas vías de señalización asociadas tanto a la progresión como al arresto del ciclo celular. Por otro lado, H. pylori ha demostrado inducir los niveles del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α), un factor transcripcional relacionado con la expresión de genes necesarios para la progresión tumoral. Fuera de sus funciones canónicas, se ha descrito que, en el contexto de la hipoxia, HIF-1α es capaz de promover arresto del ciclo celular en la fase G1 como parte de una acción no transcripcional. No obstante esto, HIF- 1α puede ser inducido por la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, vía de señalización relacionada con progresión del ciclo celular que ha sido asociada también a la acción de H. pylori. Aunque se ha descrito que la infección con H. pylori promueve la inducción de HIF-1α, actualmente no hay antecedentes precisos acerca de la vía de señalización precedente a este fenómeno, así como tampoco de su efecto sobre el destino de las células epiteliales gástricas. En este trabajo se buscó determinar si HIF-1α representa una transición desde señales que promueven un progreso del ciclo celular hacia un arresto del ciclo celular en la infección con H. pylori. En consecuencia, se propuso estudiar si H. pylori, al activar la vía PI3K/Akt/mTOR, podría llevar a un aumento de los niveles de HIF-1α y éste, a su vez, llevar a una respuesta de arresto del ciclo celular. Para estudiar esto, se utilizó un modelo in vitro basado en células humanas derivadas de cáncer gástrico MKN45 y AGS y la cepa de H. pylori 26695. Los resultados indican que H. pylori induce un aumento transitorio de HIF-1α con localización principalmente nuclear. Al inhibir farmacológicamente la vía PI3K/Akt/mTOR, se obtuvo que la inhibición de PI3K con LY294002 y de mTOR con Rapamicina fueron capaces de prevenir la inducción de HIF-1α por H. pylori. Al silenciar HIF-1α se obtuvo una reducción del arresto del ciclo celular en G0/G1 promovido por la bacteria. Consecuente con esto, los niveles de la proteína ciclina D1, importante para lograr la transición G1/S del ciclo celular, fueron diminuidos por la infección con H. pylori, sin embargo, esta diminución fue menos severa en las células que se silenció HIF-1α. En cuanto a su actividad transcripcional, se observó que al silenciar HIF-1α se previno el aumento del mRNA de GLUT-1 promovido por H. pylori sólo a tiempos tempranos de infección, pero éstos no fueron afectados a tiempos mayores. Por lo demás, el análisis bioinformático mostró que la infección con H. pylori no incrementó significativamente la expresión de genes blancos clásicos de HIF-1α en la mucosa antral. Finalmente, al analizar la acción de los componentes solubles o de la pared de H. pylori sobre la inducción de HIF-1α, se obtuvo que ninguno de ellos fue capaz de promover este efecto, sólo el contacto directo entre el patógeno vivo y el hospedero fue necesario para promover un aumento de los niveles de la proteína. En resumen, los resultados sugieren que H. pylori promueve un aumento de HIF-1α a través de la activación de PI3K y mTOR, y que esta inducción permite el arresto de células gástricas en la fase G0/G1 del ciclo celular. Además, HIF-1α tendría una participación menor en la expresión de su gen blanco GLUT-1. Finalmente, los datos sugieren que el factor de virulencia posiblemente implicado en este fenómeno requiere de la interacción directa entre H. pylori y la célula gástrica para ejercer su función

Helicobacter pylori (H. pylori) is a human gastric pathogen whose presence is linked to gastric carcinogenesis. In gastric epithelial cells, H. pylori infection promotes activation of several signaling pathways associated with both cell cycle progression and cell cycle arrest. On another hand, H. pylori has been linked to the induction of Hipoxia Inducible Factor -1α (HIF-1α), a transcription factor involved in the expression of several genes required for tumor progression. In addition to its canonical functions, in the context of hypoxia, HIF- 1α has been shown to promote cell cycle arrest in G1 phase as a nontranscriptional mode of action. HIF-1α induction in normoxia by activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway has been described, and signaling via this pathway related to cell cycle progression also has been linked to H. pylori infection. However, although H. pylori reportedly promotes HIF-1α induction, currently little data is available concerning the signaling pathway(s) by which H. pylori promotes HIF-1α induction, as well as the consequences of such induction for cell fate. In this study, we sought to determine whether HIF-1α mediates the transition from cell cycle progression to cell cycle arrest observed following H. pylori infection. Thus, we evaluated whether activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway increases HIF-1α levels and whether this leads to cell cycle arrest. To do so, these studies employed as in vitro models the human gastric cancer cell lines MKN45 and AGS as well as the H. pylori 26695 strain. The results indicate that H. pylori induces transient HIF-1α increases and enhances nuclear localization of the transcription factor. Pharmacological inhibiton of the PI3K/Akt/mTOR pathway revealed that the PI3K inhibitor LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin precluded H. pylori-enhanced HIF-1α induction. HIF-1α silencing prevented H. pylori-induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. Consequently, cyclin D1, an important protein for G1-S phase transition, decreased following H. pylori infection, and this decrease was less dramatic in HIF-1α knockdown gastric cells. With respect to HIF-1α transcriptional activity, we observed that HIF-1α silencing precluded increases in GLUT-1 mRNA promoted by H. pylori at early stages of infection only. Furthermore, bioinformatic analysis revealed that H. pylori infection was not associated with an increase in the expression of classical HIF-1α target genes in antral mucosa. Finally, analysis of the contribution of soluble components or components from the bacterial wall to HIF-1α induction, revealed that none of them individually were sufficient to promote the effect. Rather, the direct interaction between live bacteria and gastric cells was neccessary for H. pylori to increase HIF-1α protein levels. In summary, the results obtained in this thesis suggest that H. pylori increases of HIF-1α protein levels in normoxia through PI3K and mTOR activation, and that this induction promotes cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Furthermore, HIF-1α appears to participate to some extent in modulating the expression of the target gene GLUT-1. Finally, the putative virulence factor involved in these events requires the direct interaction between bacteria and the host cell to exert its effect