Aislamiento y caracterización molecular de aislados virales obtenidos de pollos Broiler con artritis y tendosinovitis

Abstract

En el presente trabajo se realizó una caracterización molecular a aislados virales de Reovirus aviar. Las muestras se obtuvieron a partir de aves que presentaron signología clínica semejante a la descrita para la artritis viral o tendosinovitis. Se obtuvo líquido sinovial de las articulaciones afectadas, el que fue inoculado en la membrana corioalantoídea de huevos embrionados de pollo SPF de 10 días de incubación y se incubaron por 5 días más. A partir de las membranas que presentaron lesiones significativas se extrajo el RNA de los virus que pudieran haber mediante el kit PureLink® Viral RNA/DNA Mini Kit. Se realizó la prueba de RT-PCR usando las enzimas SuperScript III ® y Platinum Taq Polimerase ®. Se usaron 4 sets de partidores, cada set teniendo como blanco parte de cada uno de los segmentos cortos (S1, S2, S3 y S4) del genoma del virus. Los productos del RT-PCR se sometieron a electroforesis en agar noble al 1% mezclado con Red Gel® y fueron observados en un transiluminador UV. Desde el gel se extrajo el ADN amplificado de las muestras positivas usando el kit Nucleospin® Extract II, sólo para la parte del fragmento S1 del genoma que codifica la proteína σC. Este purificado fue secuenciado usando el método de Sanger y las secuencias fueron analizadas usando el programa computacional Geneious® versión 4.8.5. El análisis consistió en comparar secuencias genéticas codificantes de la proteína sigma C de cepas vacunales conocidas con respecto a las cepas aisladas, asimismo para las secuencias aminoacídicas. Los resultados mostraron que la secuencia genética que codifica a la proteína sigma C de cepas de campo difiere de cepas vacunales hasta en un 43% y que las secuencias aminoacídicas se diferencian hasta en un 52,2% entre estos aislados. Esta proteína tiene especial importancia en el desarrollo de una respuesta inmune protectiva contra la enfermedad.

In the present work, a molecular characterization of avian reovirus isolates is performed. Samples were obtained from birds that showed signology similar to that described for clinical viral arthritis or tenosynovitis. The samples consisted of synovial fluid from affected joints, which was inoculated on the chorioallantoic membrane of SPF embryonated chicken eggs. From the membranes that showed significant injuries, RNA was extracted using the PureLink® kit Viral RNA / DNA Mini Kit. RT-PCR was performed using the SuperScript III® and Platinum® Taq Polymerase enzymes. Four sets of primers were used, each set having as target part of each of the short segments (S1, S2, S3 and S4) of the virus genome. The RT-PCR products were electrophoresed on 1% agar Noble gel mixed with Red Gel® and observed on a UV transilluminator. From the gel, the DNA amplified from positive samples was extracted using the NucleoSpin Extract II kit, only for part of the S1 genome fragment encoding the protein σC. This purified DNA was sequenced using the Sanger method and the sequences were analyzed using the computer program Geneious® version 4.8.5. The analysis involved comparing genetic sequences coding for the protein sigma C from known vaccine strains against the isolates obtained from field samples. Also the amino acid sequence was compared. The results showed that the genetic sequence encoding the protein sigma C of field strains differ by up to 43% and amino acid sequences which differ by up to 52.2% when compared with vaccines strains. This protein is particularly important in developing a protective immune response against disease.