Identificación a escala genómica de genes involucrados en la supervivencia intracelular de Salmonella Typhimurium en el protozoo Dictyostelium discoideum

Abstract

Los mecanismos moleculares que permiten a Salmonella Typhimurium causar enfermedades en mamíferos son numerosos y generan manifestaciones clínicas que abarcan desde una colitis hasta septicemia y la posterior muerte del hospedero. Estos mecanismos se relacionan con su capacidad de infectar en primera instancia células epiteliales del tracto digestivo y su posterior supervivencia y replicación en células fagocíticas. Esto es posible gracias a la existencia de factores de virulencia que se encuentran codificados en genes localizados mayoritariamente en islas de patogenicidad o en el plasmidio de virulencia de Salmonella. La gran mayoría de estos mecanismos han sido caracterizados en la infección del modelo murino o aviar. En este trabajo buscamos identificar los genes de S. Typhimirium que están implicados en la supervivencia de esta bacteria dentro de organismos eucariontes simples tales como amebas. Considerando que Salmonella podría interactuar con estos organismos en el medio ambiente, en este trabajo se usó como modelo de estudio la ameba social Dictyostelium discoideum, que de acuerdo a nuestras observaciones sería incapaz de degradar a Salmonella. Esto es interesante si se toma en cuenta que las amebas presentan una estrecha relación con los macrófagos, ya que ambas son células eucariontes que comparten muchos de los mecanismos implicados en el proceso de fagocitosis. Para estudiar la supervivencia de Salmonella al interior de D. discoideum implementamos un ensayo de competencia infectando esta ameba con S. Typhimurium 14028s y mutantes definidas. Nuestros resultados indican que las mutantes ΔinvA y ΔssaD (relacionadas directamente con la patogenicidad de Salmonella en otros modelos de infección) y ΔaroA (mutante metabólica), presentan problemas de supervivencia en D. discoideum en comparación con la cepa silvestre parental. Posteriormente, para identificar el conjunto de genes involucrados en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en este organismo modelo realizamos infecciones de D. discoideum utilizando una genoteca de ~3690 mutantes de S. Typhimurium 14028s por deleción de genes individuales, que contienen un cassette de resistencia a kanamicina. Desarrollamos un protocolo que permite amplificar y secuenciar las regiones adyacentes a la inserción de este cassette e identificar a nivel genómico cada una de las mutantes presentes en la población recuperada desde D. discoideum. Mediante este análisis a gran escala fue posible identificar un total de 81 mutantes bajo selección negativa. Entre las mutantes identificadas podemos mencionar a ΔorgB, gen que codifica un componente esencial para el funcionamiento del sistema de secreción tipo III (T3SS) codificado en la isla de patogenicidad SPI-1 y 3 mutantes (ΔssrA, ΔssaR y ΔpipB2) cuya función se asocia al T3SS codificado en la isla de patogenicidad SPI-2. El análisis a escala genómica también nos permitió tener una idea general del ambiente en el que se encuentra S. Typhimurium al interior de D. discoideum. Esta idea surge de la selección negativa que presentan mutantes en genes como rpoE y creB, que codifican proteínas que participan de la regulación transcripcional de genes asociados con la respuesta al estrés extracitoplasmático y al crecimiento en medio mínimo, respectivamente. En conjunto, los resultados de esta tesis constituyen un primer paso para comprender la interacción entre Salmonella y la ameba D. discoideum a nivel molecular

The molecular mechanisms that allow Salmonella Typhimurium to cause disease in mammals are numerous, and are responsible for clinical traits ranging from a self-limited colitis to septicemia and eventually the death of the host. These mechanisms are related to the ability of the pathogen to infect epithelial cells in the small intestine and its intracellular survival and growth in phagocytic cells of the host. This ability is the result of genes coding for virulence factors generally located in pathogenicity islands or in the Salmonella virulence plasmid. The vast majority of these mechanisms have been characterized using murine and avian infection models. In this work, we aimed to identify S. Typhimurium genes involved in the survival of this pathogen in simple eukaryotic organisms like amoebas. Considering that Salmonella can interact with these organisms in the environment, in this work we used the social amoeba Discoideum discoideum as a model. According to our data, this organism is unable to degrade Salmonella after phagocytosis. This is remarkable considering that amoebas show a close relationship with macrophages, both being eukaryotic cells that share many phagocytosis mechanisms. To study the intracellular survival of Salmonella in D. discoideum we developed a competition assay where the amoeba was infected with S. Typhimurium 14028s and selected derivative mutants. Our data show that mutants ΔinvA and ΔssaD (directly related to pathogenicity in other infection models) and ΔaroA (metabolic mutant) have an impaired intracellular survival in D. discoideum as compared to the wild-type strain. Later, in order to identify the complement of genes involved in the intracellular survival of S. Typhimurium in this organism, we infected D. discoideum using a single-gene deletion mutant library of S. Typhimurium 14028s (~3690 mutants), containing a kanamycin resistance cassette. We developed a protocol to amplify and sequence the genomic region adjacent to the resistance cassette. This protocol allowed us to identify at the genomic level the mutants present in the population of bacteria recovered from D. discoideum. Using this genomic analysis, we identified 81 mutants under negative selection. Relevant mutants in this group include ΔorgB, a gene that encodes an essential component required for the function of the T3SS encoded in SPI-1, and 3 mutants (ΔssrA, ΔssaR and ΔpipB2) in genes associated to the T3SS encoded in SPI-2. Furthermore, our genomic analysis allowed us to have a general idea of the environment faced by Salmonella within D. discoideum. This notion comes from the negative selection observed for mutants in genes such as rpoE and creB, coding proteins involved in the transcriptional regulation of genes associated to extracitoplasmatic stress and growth in minimal media, respectively. Taken together, the results in this work are the first step in the understanding of the molecular mechanisms involved in the interaction between Salmonella and D. discoideum