Desarrollo de metodologías cromatográficas HPLC para la evaluación de la capacidad antioxidante de polifenoles que interactúan con albúmina

Abstract

Los flavonoides son compuestos polifenólicos que se encuentran distribuidos en el reino vegetal. Las propiedades antioxidantes de estos compuestos se relacionan con su capacidad de atrapar radicales libres (ej. radical hidroxilo) y apagar especies excitadas (ej. oxígeno singlete). Los flavonoides poseen la capacidad de interactuar con distintas proteínas desde que se administran, al estar en la circulación sanguínea, con proteínas estructurales celulares, pudiéndose modificar tanto su biodisponibilidad como sus efectos farmacológicos. Estudios recientes sugieren que la unión con albúmina afecta la absorción, biodisponibilidad y actividad de los flavonoides, dependiendo de la estructura del polifenol. El objetivo general de este trabajo es desarrollar metodologías cromatográficas HPLC para la determinación del efecto antioxidante frente al radical hidroxilo, de polifenoles que están interactuando con albúmina en medio acuoso tampón pH 7,4, siguiendo el consumo del polifenol en función del tiempo. Así, se desarrollaron dos metodologías analíticas por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC). Una fue desarrollada con la finalidad de lograr una óptima separación del flavonoide y sus respectivos productos de oxidación. Para esta metodología se utilizó una columna de fase reversa C8 y una gradiente de elución isocrática. Por otra parte, el seguimiento del consumo de cada flavonoide en función del tiempo se realizó en una columna C18, donde estos compuestos eluyen a tiempos menores en comparación con la metodología utilizada para la separación de los posibles productos de oxidación. Ambas metodologías fueron validadas en forma preliminar utilizando concentraciones del rango micromolar, presentando una adecuada relación lineal entre la señal cromatográfica y la concentración. La metodología se aplicó eficientemente para la determinación del efecto antioxidante de morina cuando está interaccionando con albúmina en medio acuoso tampón pH 7,4 y se comparó con el medio homogéneo. Los resultados muestran que morina presenta una mayor reactividad con el radical hidroxilo cuando está interactuando con la proteína, lo que indica que aumenta su eficiencia antioxidante

Flavonoids are polyphenolic compounds that are distributed in the plant kingdom. The antioxidant properties of these compounds are related to their ability to trap free radicals (eg. hydroxyl radical) and quench excited species (eg. singlet oxygen). Flavonoids have the ability to interact with different proteins since they are administered, being in the bloodstream, with cellular structural proteins, being able to modify both their bioavailability and their pharmacological effects. Recent studies suggest that binding with albumin affects the absorption, bioavailability and activity of flavonoids, depending on the structure of the polyphenol. The general objective of this work is to develop HPLC chromatographic methodologies for the determination of the antioxidant effect against the hydroxyl radical of polyphenols that are interacting with albumin in aqueous buffer pH 7.4, following the consumption of polyphenol as a function of time. Thus, two analytical methodologies were developed by High performance Liquid Chromatography (HPLC). One was developed with the purpose of achieving an optimum separation of the flavonoid and its respective oxidation products. For this methodology, a C8 reverse phase column and an isocratic elution gradient were used. On the other hand, the monitoring of the consumption of each flavonoid as a function of time was carried out in a C18 column, where these compounds elute at shorter times in comparison with the methodology used for the separation of the possible oxidation products. Both methodologies were validated in a preliminary way using concentrations of the micromolar range, presenting an adequate linear relationship between the chromatographic signal and the concentration. The methodology was applied efficiently for the determination of the antioxidant effect of morin when interacting with albumin in an aqueous buffer pH 7.4 and was compared with the homogeneous medium. The results show that morin presents a greater reactivity with the hydroxyl radical when it is interacting with the protein, which indicates that it increases its antioxidant efficiency