Actividad inhibitoria sobre enzimas que regulan la glicemia y efecto antioxidante de una serie nueva de cumarinas sintéticas

Abstract

La diabetes mellitus de tipo dos (DMT2) es una enfermedad metabólica caracterizada por un incremento crónico de la glicemia y un desequilibrio oxidativo que a largo plazo conllevan a la aparición de una serie de complicaciones fisiopatológicas, las que se traducen en un elevado costo social y económico. Para el tratamiento de la DMT2 han surgido nuevos blancos farmacológicos de importancia en el control glicémico, como la glicógeno fosforilasa A (GPa) que aumenta la glucogenólisis, la α-glucosidasa que cataliza la hidrólisis de disacáridos a monosacáridos absorbibles; y la proteína tirosina fosfatasa- 1B (PTP-1B) que participa en la internalización del receptor de insulina, aumentando la resistencia a dicha hormona en los órganos periféricos. La DMT2 es una patología compleja y multietiológica, de gran impacto mundial, a pesar de los esfuerzos realizados para encontrar un tratamiento adecuado, la mayoría de los fármacos actuales dirigidos a un solo blanco farmacológico, han sido inadecuados para alcanzar un control glicémico completamente satisfactorio. En los años recientes, fármacos dirigidos a múltiples blancos farmacológicos, han permitido estrategias más efectivas para el tratamiento de la DMT2 (Zhang et al., 2012). Las cumarinas, compuestos químicos formados por la unión de un benceno y una α-pirona, son una familia de moléculas con diversas actividades farmacológicas, entre ellas, han demostrado poseer efectos hipoglicemiantes y capacidad de aumentar los niveles de insulina plasmática en ratas diabéticas. También han demostrado poseer actividad inhibitoria in vitro sobre la α- glucosidasa, PTP-1B u otras enzimas de importancia en la DMT2. Además, a las cumarinas se le han atribuido considerables efectos antioxidantes lo que secundariamente podría atenuar el progreso clínico y las manifestaciones fisiopatológicas de la hiperglicemia crónica observada en la diabetes. Con la finalidad de encontrar nuevas moléculas que pudiesen conseguir beneficios en el tratamiento de la DMT2, en este trabajo se estudió una serie de nuevas cumarinas previamente sintetizadas, con el fin de estudiar sus efectos inhibitorios sobre las enzimas glicógeno fosforilasa A, α-glucosidasa y la proteína tirosina fosfatasa-1B; junto con analizar la capacidad antioxidante, debido a la importancia del estrés oxidativo en el desarrollo y progresión de la DMT2. Para la selección de éstas, se dispuso de una biblioteca de cumarinas previamente sintetizadas y se realizó un análisis bibliográfico con el objetivo de relacionar dichas estructuras propuestas en la biblioteca, con otras cumarinas o moléculas similares que demostraran beneficios frente a la diabetes y así, seleccionar una serie que compartiera los mismos sustituyentes o bioisósteros de éstos, que podrían tener mejor actividad que las moléculas reportadas en literatura. Considerando además para la selección, las cumarinas con estructuras químicas con potencial efecto antioxidante. Los objetivos de este trabajo fueron determinar la potencia inhibitoria, el tipo de inhibición y las interacciones inhibidor-enzima más importantes (mediante docking), frente a GPa, α-glucosidasa y PTP-1B. Además, determinar el efecto antioxidante in vitro frente a los radicales peroxilos (mediante ORAC-FL) e hidroxilos (mediante EPR) y evaluar la capacidad antioxidante celular (células RAW 264.7) de las cumarinas seleccionadas. Como resultado se obtuvo que varias cumarinas (CUM 11,16,17,18 y 19) inhibieron de forma potente a α-glucosidasa y a PTP-1B en un rango micromolar, siendo significativamente más potentes que los inhibidores estándar utilizados; CUM 16 y 17 además lograron inhibir a GPa. Todas las cumarinas se unieron al sitio catalítico de α-glucosidasa, en una zona más externa que el sustrato, pero de importancia para su anclaje, logrando de esta forma, la inhibición de la enzima sin competir de forma directa con el sustrato. Para GPa y PTP-1B no se pudo determinar el sitio de unión de las cumarinas, pero es probable que se unan en el sitio alostérico. En todas las enzimas se describieron diversas interacciones aromáticas e hidrofóbicas con las cumarinas, teniendo gran importancia los sustituyentes tipo aromáticos. Todas las cumarinas demostraron actividad antioxidante moderada frente a ambos radicales, peroxilo e hidroxilo, además de cierta actividad antioxidante celular logrando atravesar las membranas citoplasmáticas celulares. En la serie de cumarinas analizadas, destacan como inhibidoras enzimáticas las bromotiofeno cumarinas, especialmente CUM 16, ya que inhibe con gran potencia a las tres enzimas en estudio, α-glucosidasa (CI50: 2,19 μM ± 0,17), GPa (CI50: 5,21 μM ± 0,51) y PTP-1B (CI50: 2,10 μM ± 0,28), además, esta cumarina manifestó un índice ORAC-FL de 1,59 ± 0,01; atrapamiento del radical hidroxilo en 29,3 % ± 7,5 mediante EPR no catalítico y un 56,9 % ± 15,6 mediante EPR fotolítico y actividad antioxidante celular de 27,2 % ± 0,4. Por lo tanto, es una excelente candidata para proseguir con estudios preclínicos como tratamiento farmacológico para DMT2

Diabetes mellitus type two (DMT2) is a metabolic disease characterized by a chronic increase in glycaemia and an oxidative imbalance that in the long term lead to the appearance of a series of physiopathological complications, which leads to a higher economic and social cost. For the treatment of DMT2, new pharmacological targets of importance in glycemic control have emerged, such as glycogen phosphorylase A (GPa) that increases glycogenolysis, α-glucosidase that catalyzes the hydrolysis of disaccharides to absorbable monosaccharides; and the protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) that participates in the internalization of the insulin receptor, increasing the resistance to said hormone in the peripheral organs. DMT2 is a complex and multietiological pathology, with great global impact, despite the efforts made to find an adequate treatment, most of the current drugs focused to a single pharmacological target, have been inadequate to achieve a completely satisfactory glycemic control. In recent years, drugs aimed at multiple pharmacological targets have allowed more effective strategies for the treatment of DMT2 (Zhang et al., 2012). The coumarins, chemical compounds formed by the union of a benzene and an α-pyrone, are a family of molecules with diverse pharmacological activities, among them, they have demonstrated to have hypoglycemic effects and capacity to increase the plasma insulin levels in diabetic rats. They have also shown to have inhibitory activity in vitro on α-glucosidase, PTP-1B or other enzymes of importance in DMT2. In addition, coumarins have been attributed significant antioxidant effects which could secondarily attenuate the clinical progress and pathophysiological manifestations of chronic hyperglycemia observed in diabetes. With the purpose of finding new molecules that could bring benefits in the treatment of DMT2, in this work we studied a series of new coumarins previously synthesized, in order to study their inhibitory effects on the enzymes glycogen phosphorylase A, α-glucosidase and protein tyrosine phosphatase-1B; along with analyzing the antioxidant capacity, due to the importance of oxidative stress in the development and progression of DMT2. For the selection of these, a library of previously synthesized coumarins was available and a bibliographic analysis was carried out in order to relate these structures proposed in the library, with other coumarins or similar molecules that demonstrate benefits against diabetes and thus select a series that shared the same substituents or bioisosters, which could have better activity than the molecules reported in literature. Considering also for the selection, the coumarins with chemical structures with potential antioxidant effect. The objectives of this work were to determine the inhibitory potency, the type of inhibition and the most important inhibitor-enzyme interactions (through docking), against GPa, α-glucosidase and PTP-1B. In addition, determine the antioxidant effect in vitro against the peroxyl radicals (by ORAC-FL) and hydroxyls (by EPR) and evaluate the cellular antioxidant capacity (RAW 264.7 cells) of the selected coumarins. As a result, it was obtained that several coumarins (CUM 11,16,17,18 and 19) potently inhibited α-glucosidase and PTP-1B in a micromolar range, being significantly more potent than the standard inhibitors used; CUM 16 and 17 also managed to inhibit GPa. All the coumarins were linked to the catalytic site of α-glucosidase, in a zone more external than the substrate, but of importance for its anchoring, thus achieving the inhibition of the enzyme without competing directly with the substrate. For GPa and PTP-1B the binding site of the coumarins could not be determined, but it is likely that they bind at the allosteric site. In all the enzymes, various aromatic and hydrophobic interactions were described with the coumarins, therefore the aromatic type substituents having great importance. All the coumarins demonstrated moderate antioxidant activity against both radicals, peroxyl and hydroxyl, as well as certain cellular antioxidant activity, crossing the cellular cytoplasmic membranes. In the series of coumarins analyzed, bromotiophene coumarins stand out as enzymatic inhibitors, especially CUM 16, since inhibit with high potency the three enzymes under study, α- glucosidase (IC50: 2.19 μM ± 0.17), GPa ( IC50: 5.21 μM ± 0.51) and PTP-1B (IC50: 2.10 μM ± 0.28), in addition, this coumarin showed an ORAC-FL index of 1.59 ± 0.01; scavenging of the hydroxyl radical in 29.3% ± 7.5 by non-catalytic EPR and 56.9% ± 15.6 by photolytic EPR and cellular antioxidant activity of 27.2% ± 0.4. Therefore, it is an excellent candidate to continue with preclinical studies as a pharmacological treatment for DMT2