Biosíntesis de ácido hialurónico en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

El ácido hialurónico es un polímero que pertenece a los glicosaminglicanos formado por subunidades repetidas de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico, forma parte de la matriz extracelular en organismos vertebrados como los humanos y posee atractivas propiedades que son de gran interés comercial en el área alimenticia, cosmética y médica. Por esta razón en la última década ha aumentado el uso de la fermentación de microorganismos para su producción con tal de mejorar parámetros de calidad, como su pureza y peso molecular y como alternativa para reemplazar los procesos de obtención actual. Saccharomyces cerevisiae es una levadura que si bien no produce naturalmente ácido hialurónico posee ventajas favorables para su posible escalamiento y producción. Debido al amplio conocimiento y herramientas genéticas que existen de este microorganismo es un hospedero atractivo para la producción de este polímero. En este trabajo se buscó obtener una cepa de S. cerevisiae capaz de producir ácido hialurónico. Para ello se utilizaron enzimas provenientes del microorganismo Streptococcus pyogenes el cual produce naturalmente este polímero. Se ensamblaron 3 módulos de expresión mediante Gibson Assembly utilizando promotores y terminadores nativos de S. cerevisiae, estos corresponden a; El marcador de selección ura3, el cual nos permitirá identificar mediante selección positiva. El módulo de expresión de la hialuronato sintasa (HasA) que polimeriza N-acetilglucosamina y ácido D-glucurónico para sintetizar ácido hialurónico. Finalmente el módulo de expresión de la UDP-glucosa deshidrogenasa (HasB), el cual es fundamental para obtener el precursor ácido D-glucurónico, el cual no se encuentra disponible de manera nativa en S. cerevisiae. A través de recombinación homóloga in vivo se intentó integrar el cluster completo en el cromosoma V en una cepa que posee una deleción en el gen ura3. Se logró obtenerdos de los tres módulos antes mencionados de manera independiente y se validó el funcionamiento del marcador de selección sintético propuesto para curar la auxotrofía del hospedero, no fue posible obtener cepas recombinantes para el constructo completo de expresión para ambas enzimas en el microorganismo S. cerevisiae.

Hyaluronic acid is a polymer that belongs to the class of glycosaminglycans and it is composed of repeating subunits of N-acetylglucosamine and glucuronic acid. It is part of the extracellular matrix in vertebrates, such as humans. Furthermore, it has several properties which make it an important product in the food, cosmetic and medical industries. During the last decade the production of HA by microbial fermentation has been improving in order to get better parameters such as purity and molecular weight. S. cerevisiae is a yeast which does not produce hyaluronic acid, but it has some advantages that make it a promising cell-factory. Due to the extensive knowledge and genetic tools about S. cerevisiae, it is an interesting host for the heterologous production of hyaluronic acid. The aim of this work was to obtain a S. cerevisiae strain able to produce hyaluronic acid. In this work, two enzymes of S. pyogenes, which is a hyaluronic acid producer, were selected, The Gibson assembly technique was used to make three clusters with native yeast promoters and terminators; the selectable marker ura3, the hyaluronate synthase (HasA) expression module, enzyme that polymerized N-acetilglucosamine and glucuronic acid to produce hyaluronic acid; and, the UDP-glucose dehydrogenase (HasB) expression module, which is the key to obtain the glucuronic acid precursor because it is not produced naturally by S. cerevisiae. Through in vivo homologous recombination we tried to integrate the full cluster in chromosome V of a S. cerevisiae strain with an ura3 gene deletion. Two modules were successfully assembled, and the synthetic selectable marker to revert the auxotrophy mutation was validated. However, it was not possible to obtain S. cerevisiae transformant strains with the entire expression cluster that contains both enzymes.