La administración sistémica de secretoma obtenido de células madre mesenquimáticas precondicionadas in vitro con deferoxamina, disminuye la atrofia axonal, la apoptosis de las células de Schwann y la pérdida de mielina en nervio ciático junto con estimular la regeneración axonal en el modelo animal de neuropatía diabética BKS DB/DB

Abstract

En la neuropatía diabética (ND) es una de las principales complicaciones de la diabetes mellitus (DM) afectando aproximadamente al 60% de los pacientes diabéticos. Se ha propuesto el aumento en el nivel de especies reactivas del oxígeno (ROS), debido al metabolismo exacerbado de glucosa, como el principal detonante en esta patología, induciendo daño estructural en los nervios periféricos en varios niveles. Las neuronas y las células de Schwann son especialmente sensibles a este ambiente oxidativo, lo que induce la apoptosis de estas células y finalmente la degeneración axonal en nervios sensitivos y la muerte neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRGs) conduciendo a perdida de sensibilidad. Recientemente, se ha propuesto el uso de células madre para el tratamiento de enfermedades complejas como la ND. Entre éstas, las células madres mesenquimáticas (MSC) son capaces de secretar un amplio espectro de moléculas terapéuticas, lo que se conoce como secretoma. En humanos, el secretoma de MSC consta de cientos de factores que incluyen citoquinas antiinflamatorias, factores tróficos y moléculas antioxidantes. Además, se ha descrito que el precondicionamiento de las MSC con el agente mimético de hipoxia deferoxamina (DFX) induce un aumento significativo en la secreción de factores angiogénicos, neuroprotectores, antiinflamatorios y antioxidantes, por lo que podría erigirse como un biofármaco con gran potencial para el tratamiento de la ND. En base a estos antecedentes, en esta tesis postulamos que la administración sistémica de secretoma obtenido de células madre mesenquimáticas precondicionadas in vitro con deferoxamina, mejora la regeneración axonal, reduce la apoptosis de neuronas y de células de Schwann y disminuye la pérdida de mielina en nervio ciático en el modelo animal de neuropatía diabética BKS db/db. Para ello, se extrajeron los nervios ciáticos y DRGs de animales diabéticos tratados con vehículo, animales diabéticos tratados con secretoma de MSC precondicionadas y no precondicionadas y de animales sanos a las 26 semanas de edad. En el nervio ciático se realizaron cortes semifinos teñidos con azul de toluidina para cuantificar el diámetro axonal, por medio de microscopía electrónica se determinó el radio G, y mediante RT-qPCR se analizó la expresión de genes relacionados con la desmielinización. Además, se midió el número de células TUNEL+ en el nervio ciático y en DRGs. Por último, se realizaron cultivos de neuronas de DRGs para analizar el crecimiento de neuritas, en lo que constituye un modelo simplificado de regeneración in vitro. Se observó que el tratamiento de animales diabéticos con secretoma de MSC evitó tanto la pérdida de fibras de mayor diámetro en el nervio ciático, como también la disminución en el grosor de la capa de mielina en las fibras pequeñas y redujo la apoptosis de células de Schwann en comparación con animales diabéticos tratados con vehículo. Adicionalmente, el tratamiento con secretoma derivado de MSC mejoró la regeneración neurítica y disminuyó la apoptosis neuronal en los DRGs en comparación con animales diabéticos sin tratamiento. De acuerdo con lo anterior, postulamos que el secretoma de MSC podría ser usado como un nuevo biofármaco para tratar las principales alteraciones estructurales asociadas a la ND

Diabetic Neuropathy (DN) is one of the most common complications of diabetes mellitus (DM), affecting 60% of diabetic patients. It has been postulated that the increased level of reactive oxygen species (ROS), due to the exacerbated glucose metabolism, is the main trigger in this pathology, inducing structural damage of peripheral nerves at various levels. Neurons and Schwann cells are especially sensitive to this oxidative environment, inducing the apoptosis of these cells and leading to axonal degeneration in sensory nerves and neuronal death in the dorsal root ganglia (DRGs), which finally results in sensory loss. The use of stem cells for the treatment of complex diseases such as DN has been recently proposed. Among these cells, mesenchymal stem cells (MSCs) are cells that secrete a broad spectrum of therapeutic molecules, known as secretome. In humans, MSC secretome consists of hundreds of factors that include anti-inflammatory cytokines, trophic factors, and antioxidant molecules. Furthermore, the preconditioning of MSC with the hypoxic mimetic agent deferoxamine (DFX) allows a significant increase in the secretion of angiogenic, neuroprotective, anti-inflammatory and antioxidant factors, which could be proposed as a nextgeneration biodrug with great therapeutic potential for the treatment of DN. Therefore, in this thesis we postulate that systemic administration of secretome derived from in vitro preconditioned mesenchymal stem cells with deferoxamine, improves axonal regeneration, reduces apoptosis of neurons and Schwann cells and diminishes myelin loss in the sciatic nerve in the animal model of diabetic neuropathy BKS db/db. To carry out the histological and molecular analysis, sciatic nerves and DRGs were extracted from diabetic animals treated with the vehicle, diabetic mice treated with secretome derived from preconditioned and non-preconditioned MSC and healthy animals at 26 weeks of age. The sciatic nerves were used to obtain semi-thin sections stained with toluidine blue to quantify axonal diameter. For ultrastructural analysis of axonal fibers, the g-ratio was determined by electron microscopy and the expression of genes related to demyelination was evaluated by RT-qPCR. In addition, the number of TUNEL+ cells in the sciatic nerve and in DRGs was measured. Finally, DRGs were extracted from mice of the different experimental groups, and DRGs cultures were carried out to analyze neurite outgrowth, as a simplified in vitro regeneration assay. We showed that MSC secretome administration prevented the loss of larger diameter fibers in the sciatic nerve, as well as the decrease of myelin layer thickness in small fibers, and induced a significant reduction in Schwann cell apoptosis compared to diabetic animals treated with the vehicle. Furthermore, MSC secretome treatment improved neuritic regeneration and decreased neuronal apoptosis in DRG compared to diabetic animals treated with the vehicle. Thus, we postulate that the MSC secretome could be used as a new biodrug for the treatment of the main structural alterations of ND