Estudio de la adaptación de celulas CHSE a cultivo en suspensión y caracterización de su infección por IPNV

Abstract

La industria acuicola, en particular la del salmón atlántico, representa un eje importante en la economía chilena, ocupando un 30 % del mercado mundial del pez, posicionándose así como el segundo productor a nivel mundial. Sin embargo, existe una serie de factores patogénicos que ponen en riesgo, los cultivos, dentro de los cuales se distingue el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNv). Este último corresponde a un aquabinovirus que promueve una serie de complicaciones en el hospedero. La enfermedad generada corresponde al 36.5 % de las enfermedades de agua dulce y saladas diagnosticadas y puede presentar una mortalidad de hasta 100 % según las condiciones, presentándose así como un problema para el rubro. La empresa Veterquimica S.A lleva a cabo la producción de vacunas del virus inactivado a través de la infección de cultivos de CHSE-214 adherentes. La búsqueda de obtención de condiciones de operación que permitan obtener una mayor concentración de virus de manera rentable se vuelve entonces atractivo para la empresa. El objetivo general corresponde al estudio de la adaptación a suspensión de la linea celular chinook salmon embryo CHSE-214, además de la determinación del titulo viral obtenido desde la infección de estas células con IPNv para diferentes condiciones de cultivo. Para esto, se llevo a cabo la caracterización del cultivo en términos de parámetros de crecimiento y consumo/producción de metabolitos, según diferentes condiciones de cultivo. En particular, se realizaron dichas pruebas según las condiciones basales de la empresa, para después probarlo en MEM y DMEM-F12 con cultivos de alta densidad. Después se evaluó que medio y que densidad celular durante la infección permitía alcanzar los mayores títulos virales, con el fin de trabajar en dichas condiciones. Dado los resultados obtenidos, se probo la adaptación a suspensión del cultivo, creciendo las células en un spinner flask. Los resultados obtenidos permitieron determinar que las condiciones de cultivo en adherencia que permitían obtener la mayor densidad celular correspondían al uso de DMEM-F12 suplementado, alcanzando una concentración de 0,56 · 106 [células/cm2], siendo 1,57 veces mayor que en MEM Completo, poseyendo además un tiempo de duplicación de 67,3 [h] y un ∆Lac/∆Glc = 1,31 − 0,81. Sin embargo, la evaluación de infección con IPNv mostró que la combinación alta densidad en MEM Completo permitía un título viral 3,64 veces mayor que en DMEM-F12. Las pruebas de adaptación a suspensión mostraron una mantención de la viabilidad celular por sobre el 80 % durante un plazo de 2-3 semanas, sin embargo, los resulta- dos indican que usualmente se presentaba una muerte del cultivo. Finalmente, se procedió a proponer una serie de medidas, que podrían permitir la adaptación a suspensión en próximas pruebas. En particular, se propuso la determinación de condición de agitación óptimas, la disminución del ion calcio por su rol en la adhesión celular, pero también de lactato a menos de 6 [mM] y de glutamina a máximo 0,6 [mM] en el medio, dado sus efecto inhibitorio en la proliferación de las células. i Así, pese a que no se pudo adaptar las células a crecer en suspensión, se llevó a cabo la caracterización de los cultivos en adherencia, permitiendo entender que condiciones son, en un inicio, convenientes según el objetivo deseado. Además, se espera que la revisión bibliográfica permita mejorar próximos resultados asociados a pruebas de adaptación.