Síntesis, fotoquímica y fotofísica de una sonda fluorescente para la detección de oxígeno molecular singulete en mitocondrias

Abstract

El oxígeno singulete (1O2) es una especie electrónicamente excitada del oxígeno molecular y altamente reactiva. Pertenece a la familia de las especies reactivas de oxígeno (ROS), protagonistas de diversos procesos fisiológicos y patológicos. El 1O2 juega un papel clave en una amplia variedad de procesos químicos y biológicos, entre otros, en síntesis orgánica, terapia fotodinámica del cáncer, erradicación de microorganismos patógenos, o señalización celular. A pesar de su relevancia, solo existen algunas técnicas disponibles para monitorear el 1O2 en medios biológicos. Es por esta razón que actualmente se han desarrollado métodos de detección indirectos basados en sondas que reaccionan selectivamente con 1O2. Entre estos métodos, las sondas fluorescentes son herramientas atractivas para la detección de 1O2 en medios biológicos debido a su alta sensibilidad, respuesta rápida y la capacidad de obtención de imágenes utilizando microscopía de fluorescencia. Sondas fluorescentes furil derivados del vinilnaftoxazol (FN) que actúan bajo un mecanismo del tipo “apagado-encendido”, muestran un notable aumento de la fluorescencia del grupo naftoxazol luego de la reacción del residuo furano con 1O2. En este trabajo de tesis se sintetizó una sonda fluorescente del tipo FN (FN-12), en donde se adiciona al anillo furano una sal de trifenilfosfonio terminal, conocido como un localizador mitocondrial, con el fin de ampliar el uso de estas sondas hacia sistemas de interés biológico. La sonda FN-12 se caracterizó por métodos espectroscópicos clásicos, se analizaron sus propiedades fotofísicas y fotoquímicas y se evaluó su reactividad frente al 1O2 generado por fotosensibilización, utilizando sensibilizadores clásicos como el Nuevo Azul de Metileno y Rosa Bengala. Los resultados son prometedores; la sonda FN-12 reacciona químicamente con 1O2 alcanzando un aumento de fluorescencia de 581 veces utilizando el sensibilizador Rosa Bengala. Además, la sonda es fotoestable, presenta selectividad frente a otras ROS (radical superóxido y peróxido de hidrógeno) y posee una baja autosensibilización. Luego de los resultados del comportamiento de la sonda FN-12 en medio homogéneo, se analizó su localización celular. La sonda FN-12 fue introducida en la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano, en conjunto a un marcador mitocondrial comercial MitoTracker Red. Utilizando microscopía confocal, se observa en la imagen picos de fluorescencia superpuestos, correspondientes a la sonda FN-12 y al MitoTracker Red, lo que confirma la localización de la sonda FN-12 en la mitocondria. Considerando los resultados obtenidos, se postula a la sonda fluorescente FN-12 como una candidata idónea para monitorear la dinámica de generación de 1O2 en mitocondrias

Singlet oxygen (1O2) is an electronically excited species of molecular oxygen, highly reactive and belong to the reactive oxygen species (ROS), who have a major role in diverse pathological and physiologic process. The 1O2 play a key role on a wide chemical and biologic process, among others, organic synthesis, photodynamic therapy, eradication of pathogenic microorganism, or cellular signaling. Despite its relevant, there are only a few techniques available for monitoring the 1O2 on biologic systems. For this reason, currently have been developed indirect methods of detection, based on probe that selectively react with 1O2. Among these, fluorescent probes are attractive tools for detection of 1O2 on biological medium due to its high sensibility, quick response and ability to obtain images using fluorescence microscopy. Furyl derivatives of vinylnaphtoxazol (FN) are fluorescent probe that operates under a “turn off - on” mechanism and exhibits great enhancement of fluorescence of the naphtoxazol group, after the reaction of furan moiety with singlet oxygen. In this work, it is synthetized a fluorescent probe of FN type (FN-12), where the inclusion of triphenylphosponium terminal salt on furan moiety, a common mitochondrial tracker, it is done with the purpose of extending the use of this probe to biological systems. The probe FN-12 is characterized using classic spectroscopic methods, its photophysical and photochemical properties are also analyzed, as well as its reactivity with 1O2, generated by photosensitization using classics sensitizers like New Methylene Blue and Rose Bengal. The results were promising; the probe reacts chemically with 1O2 reaching a fluorescence increase of 581-fold using Rose Bengal as sensitizer. Also, the probe is photostable, presented selectivity over others ROS, like superoxide radical and hydrogen peroxide, and had a low autosensitization. After the results of the behavior of probe FN-12 on homogeneous medium, its cellular localization was analyzed. The probe was introduces into human neuroblastoma line cells (SH-SY5Y), together with the commercial MitoTracker Red. Using confocal microscopy, it is observed that the images show overlays peak of fluorescence, corresponding to probe FN-12 and the MitoTracker Red, confirming the mitochondrial localization of the probe. Considering the results, it is postulated that the fluorescent probe FN-12 as suitable candidate for monitoring the generation of 1O2 on mitochondria